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摘　要:目的：觀察芹菜素（API）能否增強(qiáng)人急性髓性白血�。℉L-60）細(xì)胞系細(xì)胞對順鉑（DDP）的化療敏感性。方法：取對數(shù)生長期的HL-60細(xì)胞,分為API組、DDP組、API＋DDP組與空白對照組。API組加入API,終濃度為1.0μmol·L^-1,DDP組加入DDP,終濃度分別為1.0mg·L^-1,2.0mg·L^-1,4.0mg·L^-1,API＋DDP組API終濃度為1.0μmol·L^-1,DDP分別為1.0mg·L^-1,2.0mg·L^-1和4.0mg·L^-1,空白對照組僅加入等量完全培養(yǎng)基。采用MTT比色法測定細(xì)胞生長抑制率。另取對數(shù)生長期的HL-60細(xì)胞,分組同上,采用流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡率。另取對數(shù)生長期的HL-60細(xì)胞,分為3組,前2組加入1.0μmol·L^-1API,分別培養(yǎng)24h,48h,對照組僅加入等量完全培養(yǎng)基,采用間接免疫熒光標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)觀察API對HL-60細(xì)胞NF-κB和Bcl-2表達(dá)的影響。結(jié)果：1.0μmol·L^-1API無細(xì)胞毒作用,不能有效誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞的凋亡,但它與不同濃度的DDP合用,可增強(qiáng)DDP對HL-60細(xì)胞增殖的抑制作用,并使細(xì)胞凋亡率明顯增加。1.0μmol·L^-1API可抑制HL-60細(xì)胞NF-κB和Bcl-2的表達(dá)（P均〈0.01）。結(jié)論：API可增強(qiáng)DDP對HL-60細(xì)胞增殖的抑制作用和誘導(dǎo)凋亡作用,其機(jī)制可能與下調(diào)NF-κB和Bcl-2的表達(dá)有關(guān)。

 關(guān)鍵詞:人急性髓性白血病 芹菜素 順鉑 凋亡

 Chemosensitization effects of apigenin on cisplatin in human acute myeloid leukaemia HL-60 cells

 Abstract:Aim ： To observe the chemosensitization effects of apigenin （API） on cisplatin （DDP） in human acute myeloid leukaemia HL-60 cells. Methods： Ⅰ ： HL-60 cells were allocated into API group, DDP groups, API ＋ DDP groups, and control group. API group was given 1.0 μmg·L^-1 API, DDP groups were given 1.0 mg·L^-1 DDP, 2.0 mg · L^-1 DDP,4.0 mg · L^-1 DDP,respectively, and API ＋ DDP groups were given 1.0 μmol · L^-1 API plus 1.0 mg · L^-1 DDP,2.0 mg· L^-1 DDP,4.0 mg · L^-1 DDP, respectively. Control group was only given culture fluid. The inhibition rate of cell growth was detected using MTT assay, Ⅱ - HL-60 cells were allocated as above method and the apoptosis rate was determined using flow cytometry. Ⅲ ： HL-60 cells were allocated into API groups and control group. API groups were given 1.0 μmol·L^-1 API and cultured for 24 h, 48 h, respectively, and the control group was only given culture fluid. The expressions of NF-κB and Bcl-2 in HL-60 cells were detected using immunofluorescence flow cytometry. Results： 1.0 μmol · L^-1 API had no cytotoxic effects on HL-60 cells and did not induce cell apoptosis but after being combined with DDP, the inhibition rate and the apoptosis rate increased, and the expressions of NF-κB and Bcl-2 were downregulated compared with DDP groups. Conclusion： API promotes proliferative inhibition and apoptotic induction of HL-60 cells by DDP, which may associate with its downregulating the expressions of NF-κB and Bcl-2 protein.

 Key words:human acute myeloid leukaemia ; apigenin ; cisplatin ; apoptosis

 多酚類黃酮化合物芹菜素(4 5，7一三羥基黃酮， API)具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抗病毒、抗高血壓、鎮(zhèn)靜等作用。其中，以抗腫瘤作用最為突出，研究表明， API可抑制黑色素瘤的生長、侵人和轉(zhuǎn)移⋯ ；能選擇性誘導(dǎo)前列腺腫瘤細(xì)胞的凋亡 。 ，對甲狀腺癌細(xì)胞 生長有明顯的抑制作用 引，可誘導(dǎo)人急性髓性白血 病HL-60細(xì)胞凋亡 。為探討API的化療增敏作用， 作者觀察了API對順鉑(DDP)抑制HL-60細(xì)胞增殖 和凋亡的影響。

 1 材料與方法

 1．1 藥物與試劑

 注射用DDP為齊魯制藥有限公司產(chǎn)品。API為美國Sigma公司產(chǎn)品。FITC標(biāo)記山 羊抗鼠IgG、TRITC標(biāo)記兔抗山羊IgG 由Santa Cruz 公司生產(chǎn)；NF．KB山羊抗人多克隆抗體為TBD Science 產(chǎn)品．Bcl-2鼠抗人單克隆抗體為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品。

 1．2 細(xì)胞培養(yǎng)

 HL-60細(xì)胞系細(xì)胞購自中國典型 培養(yǎng)物保藏中心(武漢市)，用含體積分?jǐn)?shù)10％小牛 血清(FCS)的RPMI 1640培養(yǎng)基在體積分?jǐn)?shù)5％ CO ，37℃ ，飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，2～3 d 傳代1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。

 1．3 細(xì)胞增殖活性測定

 取對數(shù)生長期的HL-60 細(xì)胞以5×l0 ／孑L接種于96孑L板，分為API組、DDP 組、API+DDP組與空白對照組。API組加入API， 調(diào)整終濃度為1．0 gmol·L～，DDP組加入DDP，調(diào) 整終濃度分別為 1．0 mg·L～，2．0 mg·L～，和4．0 mg·L～，API+DDP組加入API和DDP，使API最 終濃度為1．0 m01．L～，DDP分別為1．0 mg· L～，2．0 mg·L 和4．0 mg·L～，空白對照組僅加 入等量完全培養(yǎng)基，每組設(shè)4個復(fù)孑L。培養(yǎng)48 h 后，各組每孑L均加入10 L 5 g／L MTT溶液，繼續(xù)培 養(yǎng)6 h，1000 r／min離心，吸去培養(yǎng)基后每孔加入100 L二甲基亞砜溶液，振蕩，用酶聯(lián)免疫儀檢測各孔 在490 nm波長下的吸光度(A)，計算細(xì)胞的生長抑 制率(IR )：IR： (1一用藥組A值／對照組A值) ×100％ 。合并用藥效果根據(jù)文獻(xiàn)[7]求出q值，當(dāng) q<0．85時，表示2藥合用有拮抗作用；q>1．15時， 表示有增效作用；1．15≥q≥0．85時，表示有相加作 用。以上實驗重復(fù)3次。

 1．4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率

 取對數(shù)生長期 的HL-60細(xì)胞，離心棄去舊培養(yǎng)基，接種于5O ml培 養(yǎng)瓶中，每瓶4．5 ml細(xì)胞懸液，含HL-60細(xì)胞4× l0。個。分組同1．3。培養(yǎng)48 h后，收集約10。個細(xì) 胞，PBS洗2遍，棄上清液，用體積分?jǐn)?shù)75％ 的乙醇 固定，過夜，PBS洗3次后，經(jīng)0．5 g·L 的RnaseA 消化30 min，用終濃度為65 mg·L 的碘化丙錠染 色1 h后流式細(xì)胞儀(FACS420型)測定，計算細(xì)胞 凋亡率 引。

 1．5 間接免疫熒光標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測NF-KB和 Be!-2蛋白表達(dá)

 取對數(shù)生長期細(xì)胞，離心棄去舊培 養(yǎng)基，接種于培養(yǎng)瓶中，每瓶4．5 mL細(xì)胞懸液，含 HL-60細(xì)胞4×10。個。加入0．5 mL 1．0 ptmol· L～API，分別培養(yǎng)24 h、48 h，同時設(shè)空白對照組 (含等量完全培養(yǎng)基)，每組設(shè)3個復(fù)孔。收集約 l0 個細(xì)胞，PBS洗2遍，棄上清液，用預(yù)冷的體積分 數(shù)75％ 乙醇4℃ 固定，過夜。測定時洗去乙醇，加 入1：100稀釋的PPARr山羊抗人多克隆抗體或 bc1．2鼠抗人單克隆抗體，4℃ 冰浴1 h，充分洗滌， 加入二抗TRITC標(biāo)記兔抗山羊Ig G或羊抗鼠FITCIgG， 4℃ 暗處孵育30 min，上機(jī)檢測，采用EXP032 Software計數(shù)10 000個細(xì)胞中的陽性細(xì)胞，計算陽 性細(xì)胞百分率。

 1．6 統(tǒng)計學(xué)處理

 采用SPSS 11．0軟件行方差分 析，檢驗水準(zhǔn)Ot=0．05

 2 結(jié)果

 2．1 API對DDP抑制HL-60細(xì)胞增殖及凋亡的 影響

 1．0 m0l·L API無細(xì)胞毒作用，不能有效 誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞的凋亡，但它與不同濃度的DDP合 用，可增強(qiáng)DDP對HL-60細(xì)胞增殖的抑制作用，并 使細(xì)胞凋亡率明顯增加(q>1．15)。見表1、2。

 表1 API對DDP抑制HL-60細(xì)胞增殖的影響

 API為1．0 lrmol·L一

 表2 API對DDP誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡的影響

 API為1．0 ptmo|·L一

 2．2 API對HL．1；0細(xì)胞NF-KB與Bcl-2蛋白表達(dá) 的影響

 1．0／~mol·L API作用24 h、48 h可抑制 HL-60細(xì)胞NF．KB和Bcl-2蛋白的表達(dá)(表3)。

 表3 API對HL-60細(xì)胞NF-KB及Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

 與空白對照組相比，P<0．0

 3 討論

 目前對于API抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用的研究主要集中在其對細(xì)胞周期的影響上。G。期細(xì)胞能否 進(jìn)入S期以及細(xì)胞能否由G 期過渡到M期是細(xì)胞 周期能否正常運(yùn)行的2個關(guān)鍵步驟。有研究顯示 API可通過降低cyclinB1及CDK1的蛋白水平，抑 制CDK1激酶活性引起細(xì)胞G：／M 期阻滯 。 。另 有研究表明，API的另一抗腫瘤作用與誘導(dǎo)腫瘤細(xì) 胞凋亡有關(guān)，其誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制可能是通過細(xì)胞色 素C 的釋放及天冬氨酸特異性半胱氨酸酶 (caspase．9、caspase．3)的激活而實現(xiàn)的 川。此 外，API也可以通過激活P53／WAF1途徑發(fā)揮抗腫 瘤作用，API能使腫瘤細(xì)胞內(nèi)P53蛋白、P21／WAF1 蛋白水平升高，2者可使細(xì)胞周期發(fā)生阻滯，并通過 P53途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡¨ ” 。另有研究顯示， 核因子．KB(NF．KB)的活化能阻止caspase．8活化， 并引起凋亡抑制劑蛋白的表達(dá)。API能夠抑制NFKB 和Bcl-2蛋白的表達(dá)，使Bax／Bcl-2的比值發(fā)生 轉(zhuǎn)變，最終誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生.

 本實驗結(jié)果顯示：1．0 tLmol／L的API可增強(qiáng) DDP對HL-60細(xì)胞增殖的抑制作用，提示API可能 具有HL-60化療增敏的全新適應(yīng)證。本實驗結(jié)果 還顯示：1．0 tLmol／L的API能促進(jìn)DDP誘導(dǎo)的HL- 60細(xì)胞凋亡，下調(diào)HL-60細(xì)胞NF-KB和Bcl-2蛋白 的表達(dá)，提示低濃度的API可降低HL-60細(xì)胞對化 療藥物誘導(dǎo)凋亡的抗性，其機(jī)制可能與下調(diào)NF-KB 和Bcl-2的表達(dá)有關(guān)。