用HPLC法測定大鼠血漿和膽汁中芹菜素的濃度 | 用HPLC法測定大鼠血漿和膽汁中芹菜素的濃度 |
| 發(fā)布時間:2013-12-11 信息來源:admin 發(fā)布人:admin 點擊次數(shù):1631 |
芹菜素(apigenin)是一種廣泛分布于多種食用植物及中草藥中的黃酮類化合物n]。藥理研究表明，芹菜素具有抗腫瘤、抗炎、抗動脈粥樣硬化、抗血栓形成及抗焦慮等作用 j。目前，對芹菜素的作用機(jī)制及體內(nèi)藥動學(xué)的研究日益受到重視。有文獻(xiàn)報道，動物口服主要成分是木犀草素和芹菜素的菊花提取物后，HPI C法檢測不到血漿中的芹菜素∞j。有研究建立了SPE一柱切換HPLC法分析人尿液中的芹菜素濃度¨4j，但實驗條件要求較高。本研究的目的是建立HPI C法測定靜脈給藥后大鼠血漿和膽汁中的芹菜素濃度，用于芹菜素的藥動學(xué)研究。 l 材 料 1，1 儀器和試劑 1100型HPLC儀(美國Agilent 公司)。芹菜素原料藥(純度為98％ ；芹菜素對照品；戊巴比妥鈉(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院動物房提供)；甲醇(色譜純)、磷酸和乙酸乙酯(HPI C級，美國Tedia公司)；異丙醇(分析純，常熟市楊園化工有限公司)；水為本院自制雙蒸水。 1．2 動物SD雄性大鼠，體重220～270 gE上海斯萊克實驗動物責(zé)任有限公司，動物許可證號：SCXK (滬)2003—0003~。 2 方法和結(jié)果 2．1 溶液的配制 (1)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制精密稱取 芹菜素對照品2O mg，置于100 mL容量瓶中，用甲醇定容配制成濃度為200 t,g／mL的儲備液。儲備液依次用甲醇稀釋成8O、4O、20、10、5、4、2．5、1、 0．4 g／mL系列濃度，一4℃冷藏備用。(2)外標(biāo)樣品溶液的配制取空白大鼠血漿或膽汁，分別加入標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制濃度分別為0．04、0．1、0．4、1、4、 8~g／mI 的血漿外標(biāo)樣品溶液和0．25、0．5、1、2、4、 8~g／mL的膽汁外標(biāo)樣品溶液，一4℃冷藏備用。 2．2 色譜條件Dikma Cl8色譜柱(250 mm× 4．6 mm，3．5 fm)，流動相為甲醇：0．2 (V／V)磷酸水溶液：66．5：33．5，檢測波長350 nm，流速為 0．8 mL／min，柱溫35℃ ，進(jìn)樣量l0 I 。 2．3 樣品處理 取含藥肝素抗凝血漿樣品或膽汁樣品0．2 mI ，加5 mol／I 磷酸40 I ，振搖后加提取溶液(乙酸乙酯：異丙醇一19：1)0．6 mI ，充分振搖，于1．3×10 r／min(離心半徑5．8 cm)離心 5 min。血漿樣品取有機(jī)層0．45 mL，膽汁樣品取有機(jī)層0．5 mL，50。C水浴氮氣吹干，殘余物用100 fI流動相溶解，取10肚L進(jìn)樣分析。 2．4 方法學(xué)考察 2。4．1 方法專屬性 分別取6只大鼠的空白血漿和空白膽汁，按2．3項下方法操作；將一定濃度的芹菜素標(biāo)準(zhǔn)溶液加入空白血漿和膽汁中，同法操作；大鼠靜脈注射20 mg／kg芹菜素對照品后1 h取血漿樣品，同法操作；大鼠靜脈注射芹菜素對照品 20 mg／kg后2～4 h取膽汁樣品，同法操作，得到各自的色譜圖見圖1。結(jié)果表明，血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾芹菜素的測定。 2．4．2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取各個濃度的外標(biāo)樣品溶液，按2．3項下方法處理后進(jìn)樣測定。以芹菜素對照品的峰面積(A)對相應(yīng)的濃度(c)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果顯示，血漿樣品在0．04～8>g／mI 范圍內(nèi)線性良好，其回歸方程為：A一56．98 f+1．41，r一 0．999 8。膽汁樣品在0．25～8~g／mI 范圍內(nèi)線性良好，其回歸方程為：A一81．97 c一3．3l，r一 0．999 8。 2．4．3 精密度和準(zhǔn)確度實驗 取空白血漿和空白膽汁，配制低、中、高濃度分別為0．04、l、8 g／mL 的血漿質(zhì)控樣品和濃度為0．25、2、8#g／mL的膽汁質(zhì)控樣品，連續(xù)測定5 d，將質(zhì)控樣品測得濃度與配制濃度相對照，求得準(zhǔn)確度與精密度，見表1。 2．4．4 穩(wěn)定性實驗 取空白血漿和空白膽汁配制低、中、高濃度分別為0．04、1、8 g／mL的質(zhì)控樣品，分別考察樣品冷凍一解融1次和2次；室溫下放置4 h以及冷凍l周的穩(wěn)定性。每一濃度進(jìn)行3樣本分析。結(jié)果表明，質(zhì)控樣品在各條件下均穩(wěn)定 (RSD< 一3)。稀釋對高濃度樣品的準(zhǔn)確度和精密 ( 3．1 ，精密度為 至原濃度的J／2o，準(zhǔn)確度為105．6 ；膽汁樣品稀釋 ，精密度為2．5 準(zhǔn)確度為102．4 后進(jìn)樣。結(jié)果表明，血漿樣品稀釋至原濃度的1／10， 1／10和1／2o，平行操作3份，按2．3項下方法處理 汁樣品，用空白血漿或空白膽汁稀釋成原濃度的 的血漿或膽 t~g／mI 精密度的考察。制備濃度為50 度樣品進(jìn)行稀釋，并對稀釋后的樣品進(jìn)行準(zhǔn)確度和 )。由于靜脈給藥后體內(nèi)濃度范圍大，為保證測量值在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)，對高濃> 2．5 藥動學(xué)研究 2．5．1 血漿樣本采集 SD大鼠5只，尾靜脈注射給予2O mg／kg芹菜素對照品，于給藥即刻及給藥后2．5、5、10、2O、30、60、90、120、180和240 min眼眶取血，血液用適量肝素抗凝，3 000 r／min(離心半徑5．8 cm)離心10 min，血漿轉(zhuǎn)移至1．5 mL聚丙烯管，置于～2O℃冰箱保存，待測。 2．5．2 膽汁樣品采集 SD大鼠5只，用3 戊巴比妥鈉麻醉，仰臥固定，腹部切口，膽道插管完成后，尾靜脈注射20 mg／kg的芹菜素對照品，分別收集給藥后0～2、2～4、4～12、12～24 h的膽汁。收集樣本所用的聚丙烯管中先加入5 mol／I 磷酸 200 L作為穩(wěn)定劑。精密測定各時間段收集的膽汁體積，并置于一2O℃冰箱保存，待測。 2．5．3 藥動學(xué)參數(shù) 根據(jù)所測得的血藥濃度做血藥濃度一時間曲線。結(jié)果顯示，靜脈給藥后血藥濃度迅速下降，表明藥物消除迅速。利用DAS藥動學(xué)參數(shù)計算程序擬合處理，得到靜注芹菜素的血藥濃度時間曲線符合二室模型的特征，主要藥動學(xué)參數(shù)見表2。 2．5．4 膽汁排泄實驗 膽汁排泄的峰值為給藥后 O～2 h內(nèi)，24 h的總排泄量約為給藥量的5．64％ 。 3 討 論 本實驗建立了測定大鼠血漿和膽汁中芹菜素濃度的方法，并對芹菜素的藥動學(xué)進(jìn)行了初步研究。大鼠尾靜脈給予芹菜素后體內(nèi)消除較快，膽汁排泄迅速，由色譜圖可明顯看到可能的代謝產(chǎn)物色譜峰，推測為葡萄糖醛苷結(jié)合物。有研究報道，給狗灌服主要成分是木犀草素和芹菜素(含量分別為7．60 和5．19 )的菊花提取物后，血漿中不能檢測到芹菜素的含量[3]。研究者分析可能由于經(jīng)胃腸道給藥后，芹菜素轉(zhuǎn)化為木犀草素，也有可能是芹菜素快速通過膽汁排泄。因此，本研究給大鼠注射芹菜素后，考察了芹菜素在大鼠血漿和膽汁中的濃度。有體外實驗研究表明，芹菜素的代謝產(chǎn)物有木犀草素、野黃芩苷及異野黃芩苷 。作者所在的課題組正在對膽汁樣品中可能的芹菜素代謝產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)研究。 芹菜素靜脈注射后，血藥濃度范圍較大，為了使分析樣品的濃度在線性范圍內(nèi)，有必要對高濃度的樣品進(jìn)行稀釋，所以本研究考察了血漿和膽汁樣品分別稀釋至原濃度的1／10和1／2o后的準(zhǔn)確度和精密度，結(jié)果表明稀釋不影響高濃度樣品的分析測定。 |
