不同產地夏枯草中抗非小細胞肺癌成分科羅索酸的比較 | 不同產地夏枯草中抗非小細胞肺癌成分科羅索酸的比較 |
| 發(fā)布時間:2013-12-19 信息來源:admin 發(fā)布人:admin 點擊次數(shù):2844 |
摘要：目的：比較不同產地夏枯草中抗非小細胞肺癌活性成分科羅索酸的含量差異。方法：通過四甲基偶氮唑藍（MTT）和吖啶橙（AO）/溴化乙啶（EB），評價科羅索酸對非小細胞肺癌細胞的增殖抑制以及凋亡作用；建立高效液相色譜法，比較14個產地夏枯草中科羅酸的含量差異。結果：科羅索酸抑制SPC-A-1人非小細胞肺癌的生長增殖（IC50=1.05×10-6mol/L），并且誘導SPC-A-1細胞凋亡。14個產地夏枯草中科羅索酸的含量差異較大，山西產地的含量最高，河南-2產地的含量最低。結論：科羅索酸為夏枯草的抗非小細胞肺癌的活性成分，不同產地夏枯草的科羅索酸含量差異較大。 關鍵詞：夏枯草；科羅索酸；四甲基偶氮唑藍；凋亡；高效液相色譜法；產地；質量 中藥質量控制是中藥現(xiàn)代化的重要問題，涉及到原藥材、中間品、成藥以及生產中的各個環(huán)節(jié)�，F(xiàn)行的中藥評價模式主要是通過光譜、色譜技術對中藥整體性評價。但是，中藥具有能防治治療疾病的特點，對于具體的某一病癥，其藥效物質基礎是不一致的。在目前對中藥的質量控制中，多采用具體的指標，但是此指標是否是此中藥治療具體病癥的藥效物質基礎，這方面研究顯示出眾多的缺陷與不足。中藥的質量控制應對具體的病癥以具體的指標來評價。 夏枯草為唇形科植物夏枯草Prunella vulgaris L.的花穗，在我國有著悠久的藥用歷史，為《神農本草經》收錄，具有清肝、明目、止痛之功效。臨床上用用于目赤腫痛、高血壓、瘰疬、癭瘤、乳癰腫痛等癥。研究表明夏枯草具有降血壓，抗腫瘤，抗炎等活性。夏枯草含有多種活性成分，主要包括酚酸、三萜、多糖、黃酮等。在筆者前期的研究中，夏枯草提取物顯示出較強的抗非小細胞肺癌活性。初步研究結果顯示其藥效物質基礎與三萜類成分有關，其中主要以齊墩果酸和熊果酸為主要指標進行了質量差異評價�？屏_索酸為其主要的萜類成分之一，最新研究發(fā)現(xiàn)其也具有抗腫瘤活性。 在具體的活性方面，中藥的質量評價應基于與此藥效物質基礎相關的活性成分來進行評價。在本研究中，對夏枯草中科羅索酸進行了抗非小細胞肺癌的活性評價，采用高效液相色譜法，分析比較不同產地夏枯草屬藥材科羅索酸含量的差異，為更好控制夏枯草的質量提供實驗依據。 材料 1. 儀器 Agilent 1200型高效液相色譜儀，DAD檢測器；BP-211D分析電子天平（德國Sartorius公司，十萬分之一）。BUCHI Rotavapor R-220旋轉蒸發(fā)儀（瑞士），DZF-6051型真空干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；熒光顯微鏡（Olympus IX71倒置熒光顯微鏡奧林巴斯BX51，日本）。酶聯(lián)分析儀為SPECTRAmax 190（Moleculor Devices，USA）。 2. 試藥科羅索酸對照品（上海順勃生物工程技術有限公司，批號：080420，含量≥98%）。藥材購自廣州藥店，經本實驗室鑒定為Prunella vulgaris L。水為雙蒸水。甲醇、磷酸（TEDIA，色譜醇）。四甲基偶氮唑藍（MTT）、溴化乙啶（EB）和吖啶橙（AO）為Sigma公司產品。其他試劑為分析純。SPC-A-1人非小細胞肺癌細胞株（以下簡稱“SPC-A-1細胞”），購自中國科學院上海細胞庫。 方法與結果 1. 科羅索酸對SPC-A-1細胞生長抑制作用 取對數(shù)生長期SPC-A-1細胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液配成3×104/mL的單細胞懸液接種于96孔板中，每孔100μL。實驗組加90μL不含牛血清的培養(yǎng)基，另加入科羅索酸10μL，使其最終濃度分別為10×10-6、5×10-6、1×10-6、0.2×10-6、0.04×10-6、0.008×10-6、0.0016×10-6mol/L。陽性對照組加10×10-6mol/L 5-氟尿嘧啶（5-Fu），空白對照組加100μL培養(yǎng)基代替。每組設6個平行孔，另設本底對照孔（等體積含相應濃度藥物的無細胞培養(yǎng)液），置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36h，每孔加入MTT液10μL，培養(yǎng)4h，棄去每孔中的液體，每孔加DMSO 100μL，振蕩10min后置于580nm波長酶聯(lián)免疫檢測儀測定OD值，計算生長抑制率（按以下公式），求IC50值。以上實驗重復3次。 細胞生長抑制率=（對照組OD均值-實驗組OD均值）/對照組OD均值×100% 表1結果顯示，10×10-6mol/L科羅索酸對SPC-A-1細胞生長抑制率為84.66%。經SPSS軟件統(tǒng)計分析結果顯示其IC50=1.05×10-6mol/L。結果表明，科羅索酸具有較強的抑制SPC-A-1細胞增殖活性。
2. 科羅索酸對SPC-A-1細胞凋亡的影響 取對數(shù)生長期SPC-A-1細胞接種于包被多聚賴氨酸的玻片上，于24孔板中孵育。待細胞長至80%融合度時，細胞給予1×10-6、0.2×10-6、0.04×10-6mol/L的科羅索酸，按“1.”項條件孵育48h。取出玻片，PBS溶液潤洗，然后用AO/EB溶液細胞染色，并于熒光顯微鏡（Olympus IX71倒置熒光顯微鏡奧林巴斯BX51，日本）觀察拍照。細胞凋亡率評價根據綠色（正常）或瑪瑙色（凋亡）彩色面積，應用Image-Pro Plus picture分析軟件計算凋亡率。 表2結果顯示1×10-6、0.2×10-6、0.04×10-6mol/L科羅索酸組細胞的凋亡率分別為28.97%±4.41%、15.33%±0.97%、5.13%±0.97%。研究結果表明科羅索酸具有誘導SPC-A-1細胞凋亡活性。
3. 科羅索酸分析方法的建立 3.1 色譜條件色譜柱：ZORBAX C18（2.1mm×100mm，3μm），檢測波長215nm，柱溫30℃，進樣量2μL，流動相為乙腈-水（85:15），流速為0.2mL/min。在此分析條件下，樣品中科羅索酸與其他色譜峰有較好的分離度（＞1.5），峰形對稱。色譜圖見圖1。
3.2 供試品溶液的制備取夏枯草藥材，100℃烘干，粉碎機粉碎，粉末過40目篩。精密稱取1.0g樣品粉末，置100mL具塞圓底燒瓶中，加入無水甲醇，回流提取2次（2h/次，每次20mL），合并濾液，60℃條件下于旋轉蒸發(fā)儀中回收甲醇，殘渣用無水甲醇定容至10mL瓶中，過0.45μm 濾膜，即得樣品溶液。 3.3 標準曲線的制備精密稱取科羅索酸對照品適量，加無水甲醇溶解，配制成0.550mg/mL 的對照品溶液10mL，備用。取對照品溶液，依次稀釋成68.8、34.4、17.2、8.6、4.3μg/mL濃度，分別進樣分析，測定其峰面積。以峰面積為縱坐標進行線性回歸，得科羅索酸的回歸方程、相關系數(shù)、線性范圍分別為Y=36.334X+18.819（R2=0.9998），在4.29-68.75μg/mL的進樣量范圍內，與峰面積具有良好的線性關系。 3.4 精密度實驗取同一夏枯草樣品溶液，連續(xù)進樣6次，記錄保留時間及峰面積，計算科羅索酸保留時間和峰面積的RSD值分別為0.46%和2.07%。結果表明，儀器精密度良好。 3.5 重復性實驗取同一樣品粉末，按供試品溶液制備方法分別制備6份供試品溶液，按上述色譜條件測定，計算科羅索酸保留時間和峰面積的RSD值分別為0.13%和2.54%。結果表明，方法重復性良好。 3.6 穩(wěn)定性實驗取同一樣品溶液，分別于0、2、4、8、12、24h進樣測定�？屏_索酸保留時間和峰面積的RSD值分別為0.39%和1.54%。結果表明，品在24h內穩(wěn)定。 3.7 加樣回收率精密稱取已知含量的夏枯草提取物粉末6份，分別置100mL具塞圓底燒瓶中，各精密加入137.5μg/mL科羅索酸0.8mL。結果科羅索酸平均回收率98.00%，RSD值為1.28%（見表3）。
4. 不同產地夏枯草中科羅索酸含量比較取不同產地夏枯草屬藥材粉末1.0g，精密稱取，按“3.2”項下方法制備供試品溶液，測定不同產地夏枯草中科羅索酸的含量。從表4中可以看出，不同產地的夏枯草中科羅索酸含量存在著較大差異。山西產地藥材中科羅索酸含量最高，為（355.84±3.21）μg/g生藥；河南-2批次藥材科羅索酸含量最低，為（61.40±2.37）μg/g生藥。對于不同河南產地的藥材，不同批次之間也存在這接近1倍的含量差異。
討論 夏枯草作為一味抗腫瘤中藥，在中醫(yī)臨床中得到普遍的應用。在筆者過往的研究中發(fā)現(xiàn)夏枯草具有體內外抗非小細胞肺癌SPC-A-1活性，其中萜類為其最主要的活性成分�？屏_索酸為夏枯草中重要的活性成分，能夠抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡和調節(jié)細胞周期。本研究結果顯示科羅索酸具有抑制SPC-A-1細胞增殖和誘導凋亡活性�？屏_索酸為夏枯草抗非小細胞肺癌的藥效物質基礎成分。所以，在抗肺癌活性方面，科羅索酸應作為指標 性成分之一來對夏枯草的質量加以控制。 本研究通過體外細胞實驗，得出科羅索酸具有抑制腫瘤細胞增殖和誘導凋亡的作用。再此基礎上確認其為夏枯草中抗腫瘤的活性成分，進而以此為控制指標，對市場上流通的夏枯草藥材進行質量控制。目前，對于中藥材的質量控制，最大的缺點是藥 效與控制指標之間的相關性缺失，無法科學有效的控制其質量。市場上流通的不同的夏枯草抗非小細胞肺癌的活性存在著很大差異，其內在原因在于其藥效物質基礎的差異。研究結果表明，雖同為市場上流通的藥材，但是其科羅索酸含量存在著差異。 本研究中，流動相組成的選擇分別考察：乙腈-水；甲醇-水；甲醇-0.1%磷酸；乙腈-0.1%冰醋酸；甲醇-0.1%冰醋酸溶液梯度洗脫。通過比較發(fā)現(xiàn)甲醇-0.1%磷酸流動相使目標峰與其他峰較好分離，分離度較好，無其他峰干擾，且分析穩(wěn)定，故選擇甲醇-0.1%磷酸為流動相。另外，本研究分別考察了215，230，254，280，330nm波長對色譜峰分離的影響。從研究結果看，215nm波長為最佳檢測波長。本研究建立的分析方法，準確、快速、簡便、可行，可用于不同產地夏枯草的科羅索酸含量差異的比較測定，能為夏枯草的質量控制提供參考依據。 |
