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[摘要]　目的:研究茶氨酸對(duì)7日齡小雞應(yīng)激反應(yīng)的影響,與厚樸提取物(25 mg·kg-1)合用是否具有協(xié)同作用。方法:茶氨酸(12·5, 25, 50 mg·kg-1腹腔注射30 min后,記錄分離小雞和未分離小雞自主活動(dòng)、分離發(fā)聲和福爾馬林誘導(dǎo)的疼痛反應(yīng)的影響。結(jié)果:茶氨酸3個(gè)劑量和厚樸提取物(25 mg·kg-1)能顯著減輕分離小雞的悲鳴(P<0·05,P<0·01);茶氨酸25, 50 mg·kg-1對(duì)分離應(yīng)激引起的痛覺鈍抑(analgesia)有對(duì)抗作用。各組對(duì)自主活動(dòng)均無明顯影響。結(jié)論:茶氨酸與厚樸單獨(dú)應(yīng)用可以緩解小雞分離應(yīng)激反應(yīng),提示對(duì)緊張、焦慮和抑郁癥有潛的治療作用。不同劑量茶氨酸與厚樸提取物25 mg·kg-1合用協(xié)同作用不明顯。

[關(guān)鍵詞]　應(yīng)激;茶氨酸;厚樸提取物; 7日齡小雞;分離試驗(yàn)

現(xiàn)代社會(huì)中,應(yīng)激(stress)是許多疾病的基本發(fā)生因素,如高血壓、腫瘤和情感性疾病等。隨著社會(huì)壓力的逐漸增大,應(yīng)激誘發(fā)的疾病逐年增加。應(yīng)激是指機(jī)體受到各種內(nèi)外環(huán)境因素刺激時(shí)所出現(xiàn)的非特異性全身反應(yīng),引起應(yīng)激的“應(yīng)激源”包括生理因素、環(huán)境因素及心理文化因素,其主要特征為機(jī)體受到刺激后發(fā)生腎上腺�泊贵w�蚕虑鹉X活性增強(qiáng),伴有神經(jīng)、內(nèi)分泌和行為等變化。

茶氨酸(theanine,系統(tǒng)命名為N-乙基-Cl-谷氨酰胺,cl-glutamylethylamide)是茶葉中特有的一種氨基酸。1950年由日本首次從茶葉中提取,并確定了其化學(xué)結(jié)構(gòu)。茶氨酸具有多種生物學(xué)活性:如降低血壓、直接和間接的抗腫瘤作用、緩解緊張、提高學(xué)習(xí)及記憶能力等。據(jù)國外臨床驗(yàn)證服用茶氨酸,對(duì)慢性應(yīng)激引起的抑郁和焦慮有一定的防治效果。

厚樸Magnolia officinalisRehd etW ils屬木蘭科木蘭屬喬木,其樹皮為我國傳統(tǒng)芳香化濕類中藥。主要含厚樸酚、和厚樸酚及生物堿等成分。含有厚樸的湯劑在臨床上治療精神焦慮、抑郁等具有很好療效,引起廣泛關(guān)注。

本試驗(yàn)的目的在于觀察茶氨酸對(duì)小雞分離應(yīng)激和疼痛模型的影響,同時(shí)檢測(cè)茶氨酸與厚樸提取物合用是否具有增強(qiáng)作用。

1　材料和方法

1.1　動(dòng)物

北農(nóng)大3號(hào)小型粉殼商品代雄性雛雞,中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院�脖鞭r(nóng)大種禽公司提供。參照《用戶手冊(cè)》其生活習(xí)性接近自然。

1.2　藥品

茶氨酸(Thea, 99%,批號(hào)20060316),厚樸提取物(HE,類白色半結(jié)晶狀物,批號(hào)20060612,厚樸酚與和厚樸酚為80% )均由美國TG Biotek, LLL公司提供。

1.3　儀器、試劑

程控自主活動(dòng)箱ZIL��2(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所研制),直徑30 cm,內(nèi)裝4個(gè)紅外線探頭,記錄小雞自主活動(dòng)狀況。電子天平(G& GT-200型,常州)。乙醇、甲醛均為分析純(北京化工廠,20040718)。

1.4　方法

小雞孵出1 d后,放于動(dòng)物盒中,半開放式立體籠養(yǎng), 25只/盒。每日喂食6次,自由進(jìn)食與飲水。室溫(26±1)℃。濕度(50±10)%。自然光和人工光照相結(jié)合,光照時(shí)間為15 h·d-1,成活率95%。每日更換墊料,小雞從一個(gè)盒子換入另一個(gè)盒子時(shí),用手輕觸小雞,使其適應(yīng),以減少未來實(shí)驗(yàn)引起的過度反應(yīng)。連續(xù)喂養(yǎng)7 d,第8 d開始試驗(yàn)。

1.4.1　分組　本實(shí)驗(yàn)分組為2水平(分離與未分離)3因素(劑量分別為12·5, 25, 50 mg·kg-1,約為人的4~16倍)設(shè)計(jì),每組動(dòng)物20只。Thea溶解于生理鹽水中。HE先用乙醇少量溶解,緩慢加入生理鹽水至所需濃度。試驗(yàn)開始前30 min腹腔注射給藥, 2μL·g-1,以等量溶媒為對(duì)照。

1.4.2　自主活動(dòng)　實(shí)驗(yàn)中,分離組小雞每次1只單獨(dú)放入自主活動(dòng)箱。未分離組小雞每次1只放入自主活動(dòng)箱的同時(shí),將另外3只小雞一起放在活動(dòng)箱的側(cè)部,使其可以清楚地看到自己的同伴。PC專用程序分別記錄每只小雞3 min的活動(dòng)次數(shù)。

1.4.3　分離發(fā)聲(separation vocalization)試驗(yàn)　用OlympusWS-100數(shù)字聲音記錄儀記錄各組小雞鳴叫,每只3 min。記錄儀麥克風(fēng)置于小雞頭部8cm處。聲音記錄后存入計(jì)算機(jī)。利用音頻處理軟件(Cool edit pro 2·0),對(duì)小雞叫聲進(jìn)行峰值頻率(PF)和聲強(qiáng)(dB)分析[5��7]。

1.4.4　疼痛試驗(yàn)　用微量注射器將0·1%福爾馬林注入小雞足跖, 50μL/只。觀察小雞對(duì)福爾馬林的反應(yīng),記錄小雞的抬腳次數(shù)、抬腳時(shí)間(Hughes&Sufka, 1991, Sufka&Weed, 1994)和啄腳次數(shù)。

1.5　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)表示成-x±s,用SPSS軟件(12·0版)進(jìn)行t檢驗(yàn)和方差分析。

2　結(jié)果

2.1　Thea和HE提取物對(duì)小雞自主活動(dòng)和分離發(fā)聲的影響雄性小雞,隨機(jī)分為9組:Thea低、中、高劑量組(12·5, 25, 50 mg·kg-1);HE(25 mg·kg-1),不同劑量Thea加HE組(25 mg·kg-1)。記錄各組自主活動(dòng)和分離發(fā)聲情況(表1)。

結(jié)果表明,在實(shí)驗(yàn)劑量下,Thea對(duì)自主活動(dòng)沒有影響,HE對(duì)小雞自主活動(dòng)雖有輕度抑制,但無顯著性差異。分離發(fā)聲的檢測(cè)表明,分離組小雞與未分離組小雞相比,頻率改變不明顯,但叫聲明顯增強(qiáng)(dB負(fù)值減小,P<0·01),說明分離應(yīng)激可以使叫聲增強(qiáng)。給藥后鳴叫強(qiáng)度減小(P<0·05,P<0·01)。而與分離對(duì)照組相比,二藥合用以后dB不變而隨著Thea濃度增加PF有減小趨勢(shì),需要進(jìn)一步試驗(yàn)證實(shí)。由于藥物對(duì)自主活動(dòng)均無明顯影響,在此劑量下不具有鎮(zhèn)靜作用,說明小雞發(fā)聲強(qiáng)度減少與鎮(zhèn)靜作用無關(guān)。

2.2　Thea對(duì)福爾馬林誘導(dǎo)的足跖疼痛的影響

分組同前。觀察福爾馬林致痛后3 min小雞的行為表現(xiàn)。注射福爾馬林引起小雞炎性疼痛。分離組小雞疼痛鈍抑(stress�瞚nduced analgesia),疼痛持續(xù)時(shí)間明顯減少(P<0·01),說明分離應(yīng)激使疼痛感覺減弱。Thea于25 mg·kg-1和50 mg·kg-1單獨(dú)應(yīng)用,可以增加抬腳持續(xù)時(shí)間,提高疼痛感覺(P<0·05),說明其有對(duì)抗分離應(yīng)激導(dǎo)致疼痛減弱的作用。HE(25 mg·kg-1)單獨(dú)應(yīng)用對(duì)疼痛減弱反應(yīng)沒有影響[9]。從本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)來看,不同劑量的Thea合用HE(25 mg·kg-1)對(duì)此模型協(xié)同作用不明顯(表2)。

3　討論

本實(shí)驗(yàn)的目的是觀察藥物對(duì)小雞分離應(yīng)激行為的影響。離開群體可以使小雞分離發(fā)聲增加而對(duì)福爾馬林引起的疼痛感覺減弱。分離模型(separationmodels)包括靈長類動(dòng)物的母子分離、群居動(dòng)物的孤養(yǎng)等。研究表明,動(dòng)物母子分離后出現(xiàn)激越、哀鳴等特征性表現(xiàn)。最有價(jià)值的分離動(dòng)物模型是除人類之外的靈長類。然而由于稀少和昂貴,很少有人用其進(jìn)行藥物篩選或作用機(jī)制的研究。事實(shí)上,許多動(dòng)物如貓、狗、鼠和雞等都會(huì)因?yàn)榕c群體隔離出現(xiàn)絕望現(xiàn)象。其中,小雞分離模型(separation model inchicken)是最典型的抗議�步^望(protes�瞭despair)模型。孵出1周的小雞,單獨(dú)隔離,開始是困苦鳴叫(shrill calls termed distress vocalization test 1985,Gardner),頻度很高,典型者1 h后減低�？菇箲]藥、抗抑郁藥等均能明顯影響困苦鳴叫的時(shí)間;而抗膽堿藥和中樞興奮藥則無效。

在小雞分離應(yīng)激的行為改變(Frohm &Wallnau, 1983; Gallup & Suarez, 1980; Jones& Harvey,1987; Jones&Mery, 1988)中,分離發(fā)聲(Meeker&Bean, 1980)和痛覺消失(Sufka& Hughers, 1991,1994)是最常用的兩個(gè)指標(biāo)。分離發(fā)聲方法比較簡單,但需要攝像機(jī)、聲音接收系統(tǒng)和PC分析程序,限制了其應(yīng)用。近年來隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)的發(fā)展,特別是分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)影像、PC程序的應(yīng)用,為應(yīng)激等研究提供了新方法、新思路。與生物工程系合作,利用音頻處理軟件Cool editpro2·0中的頻譜分析,對(duì)小雞叫聲進(jìn)行峰值頻率(PF)分析。峰值頻率是在一段音頻頻譜中聲強(qiáng)值最高處的音頻頻率值,為反映該音頻信號(hào)特性的指標(biāo)之一。此外,峰值頻率對(duì)應(yīng)的強(qiáng)度值可以表示為小雞叫聲在這個(gè)頻率上所占成份最多,因此也可把聲強(qiáng)(dB)值作為分析比較的一種途徑。結(jié)果表明,在本實(shí)驗(yàn)條件下,分離組小雞比未分離組小雞的鳴叫在聲強(qiáng)(db)上差別明顯(P<0·01)。說明分離應(yīng)激使小雞叫聲增強(qiáng)。不同劑量的Thea和HE單獨(dú)應(yīng)用對(duì)小雞分離發(fā)聲有明顯抑制(P<0·05,P<0·01),具有潛在的抗焦慮作用。同時(shí)對(duì)自主活動(dòng)沒影響,不具有鎮(zhèn)靜催眠特性。這些藥理學(xué)特征正是人們所期待的。結(jié)合臨床病人用藥習(xí)慣,動(dòng)物試驗(yàn)多采用灌胃給藥,我們采用腹腔注射主要是在盡可能排除藥物影響的同時(shí)觀察方法的可行性。

應(yīng)激、焦慮和抑郁是當(dāng)前醫(yī)學(xué)生物學(xué)和社會(huì)科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。利用天然植物制劑改善這些癥狀已成為國際上的流行趨勢(shì)。Thea對(duì)中樞的作用機(jī)制可能與其競爭谷氨酸受體,抑制谷氨酸的興奮毒性有關(guān)。此外,Thea還能增加紋狀體的多巴胺濃度、減少5-HT的合成[14]。這些神經(jīng)遞質(zhì)與精神和行為活動(dòng)密切相關(guān)。厚樸資源豐富,其主要成分厚樸酚與和厚樸酚(0·2~0·5 mg·kg-1)對(duì)小鼠有明顯的抗焦慮作用。Thea和HE均具有心境穩(wěn)定(a feeling ofwelbeing),舒緩緊張(physicalandmental relaxation)的藥理作用,且無明顯的不良反應(yīng),有望成為不錯(cuò)的中藥制劑。

研究發(fā)現(xiàn)雛雞和哺乳動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶機(jī)制、情緒機(jī)制有很多相似之處,并在相關(guān)的腦結(jié)構(gòu)及功能上具有一定的可比性。這在一定程度上為研究人的學(xué)習(xí)、記憶、情緒反應(yīng)提供了參考。參照國外方法,研究了Thea和HE對(duì)小雞分離應(yīng)激行為的影響,為其臨床應(yīng)用提供了初步數(shù)據(jù)。