二氫楊梅素研究進展 | 二氫楊梅素研究進展 |
| 發(fā)布時間:2013-12-19 信息來源:admin 發(fā)布人:admin 點擊次數(shù):2332 |
1 來源 二氫楊梅素（Dihydromyricetin，DMY）又名雙氫楊梅素、蛇葡萄素，為二氫黃酮醇化合物，存在于葡萄科、楊梅科、杜鵑科、藤黃科、大戟科及柳科等植物中，其中在葡萄科藤茶尤為特別。二氫楊梅素廣泛分布在我國云南、廣西、廣東、江西、湖南、貴州、湖北、福建等地的顯齒蛇葡萄植物莖葉中，其含量高達37.4%~38.5%。藤茶為葡萄科蛇葡萄屬中的一種野生藤本植物，學(xué)名為顯齒蛇葡萄（Ampelopsis grossedentata）。很久以來，我國壯族和瑤族人民將其幼嫩莖葉制成保健茶，用于治療感冒發(fā)熱、咽喉腫痛、黃疸型肝炎、瘡癤等病癥，夏天泡茶數(shù)日不餿，有“神茶”之稱。經(jīng)化學(xué)成分分析，發(fā)現(xiàn)藤茶是一種富含黃酮類化合物的特殊植物，其中二氫楊梅素含量高達25%左右。何桂霞等的研究表明：相同季節(jié)內(nèi)葉中二氫楊梅素含量比莖中的含量高3～4倍；而不同產(chǎn)地的藤茶中二氫楊梅素含量高低有差異，其中以江華產(chǎn)藤茶中含量最高，其次為張家界，株洲產(chǎn)含量稍低。二氫楊梅素是較為特殊的 一種黃酮類化合物，除具有黃酮類化合物的一般特性外，還具有解除醇中毒、預(yù)防酒精肝、脂肪肝、抑制肝細胞惡化、降低肝癌的發(fā)病率等作用。近年來，藥理實驗證明藤茶總黃酮具有鎮(zhèn)痛、止咳、廣譜抗菌、降血糖、降血脂、抗氧化等多種功效，引起人們極大的關(guān)注。 2 理化性質(zhì) 二氫楊梅素［（2R，3R）-3，5，7-三羥基-2-（3，4，5-三羥基苯基）苯并二氫吡喃-4-酮］，氣特殊，白色針狀結(jié)晶，mp：245~246℃，25℃水中溶解度為4％，熱水中溶解度更大；易溶于甲醇、乙醇及丙酮，極微溶于醋酸乙酯；難溶于氯仿、石油醚。林淑英等對DMY穩(wěn)定性和影響因素進行了考察，證實二氫楊梅素溶液易發(fā)生氧化，穩(wěn)定性較差，在不超過100℃，加熱時間不超過30 min以及酸性和中性條件可保持其化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，而過渡態(tài)金屬離子Al3+，F(xiàn)e3+，Cu2+等對二氫楊梅素的氧化起誘導(dǎo)催化作用。 3 提取和純化方法 3.1 傳統(tǒng)的提取方法 傳統(tǒng)的二氫楊梅素提取方法有熱提取法（煎煮法、回流提取法）和浸泡提取法（滲透法、冷浸法），均存在費時、費溶劑、效率低、重現(xiàn)性差、提取率低等不足，而且所用溶劑通常有毒，易對環(huán)境和操作人員造成危害。但陳玉瓊等研究表明采用乙醇為提取劑，以清除超氧陰離子自由基活性為跟蹤，應(yīng)用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計方法優(yōu)化藤茶中二氫楊梅素提取的最佳條件，提取溫度控制在65 ℃，浸提時間94 min，料液比1：35，乙醇濃度74%，提取率達25%。鄭成等對干藤茶葉用乙醇浸泡進行預(yù)處理，以水為溶劑提取二氫楊梅素，考察了乙醇預(yù)處理時間、茶葉與乙醇的料液比、加熱時間等因素對提取率的影響，通過單因素分析和正交試驗設(shè)計，確定了最佳提取工藝條件參數(shù)為：乙醇預(yù)處理時間為15 h，茶與乙醇的料液比為1：8，加熱時間為30 min，在此條件下二氫楊梅素的提取率為34.23%。 3.2 微波萃取法 微波萃取法則是利用微波能來提高萃取效率600的一種新技術(shù)。不同物質(zhì)的介電常數(shù)不同，其吸收微波能的程度不同，由此產(chǎn)生的熱能及傳遞給周圍環(huán)境的熱能也不相同。它能對萃取體系中的不同組分進行選擇性加熱，具有較好的選擇性，且微波萃取受溶劑親和力的限制較小，可供選擇的溶劑較多。微波加熱利用分子極化或離子導(dǎo)電效應(yīng)直接對物質(zhì)進行加熱，因此熱效率高、升溫快速均勻，大大縮短了萃取時間，提高了萃取效率。楊鈴等研究表明：用正交設(shè)計法，以水為溶劑，考察了提取溫度、微波輻射時間及料液比3個因素，每個因素3 個水平，選擇L9（3×3）正交設(shè)計表；結(jié)果表明，影響DMY提取率的因素為提取溫度>微波輻射時間>料液比，在提取溫度為95 ℃，微波輻射時間為15 min，料液比為1：20時二氫楊梅素的提取率最高。采用微波萃取法大大的提高了提取效率，提取時間從直接熱提法的30 min減少到了15 min，而且以高效液相色譜直接測定目標成分的含量，使得檢測更加簡 便、快速。 3.3 高速逆流色譜法 高效逆流色譜分離技術(shù)是運用動態(tài)液-液分配原理，利用螺旋管的方向性與高速行星式運動相結(jié)合，使兩相互不混溶的溶劑在螺旋管中實現(xiàn)高效接觸、混合、分配和傳遞，從而將具有不同分配比的樣品組分分離出來。與其他液相色譜分離技術(shù)相比，該技術(shù)不使用固相載體作為固定相。樣品在互不相溶的兩相中分配，克服了固相載體帶來的樣品吸附、損失和污染等缺點，并能重復(fù)進樣，應(yīng)用價值較高。逆流法提取是指提取劑從第一級加入流向最后一級，而物料從最后一級加入流向第一級，即兩相逆向流動。由于DMY在熱水和冷水中的溶解度差別很大，故可選擇以水為提取劑，采用逆流法對原料中的DMY進行提取。張友勝等用Eclipse XDB-C18高效液相色譜柱（250.0 mm×4.6 mm，5μm），甲醇/水體積比36：64（用磷酸調(diào)pH至3.0）為流動相，流速為1.0 ml/min；進樣量20 μl，柱溫35 ℃，其研究表明：選用溶劑系統(tǒng)為石油醚/乙酸乙酯/甲醇/水/三氯乙酸（體積比1∶3∶2∶2∶0.05），在逆流色譜儀轉(zhuǎn)速為700~800 r/min，進樣體積為2~50 ml、流速1.5~2.5 ml/min的條件下，在5 h內(nèi)能將80％粗提物中的二氫楊梅素和楊梅素提純到99%以上，50 g粗藤茶樣品連續(xù)分離其分離得率分別為85.5%和87.6%。該方法避免了分離樣品與固態(tài)載體表面發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而性以及不可逆吸附等缺陷；殘留溶劑容易在較短時間內(nèi)沖凈，不會對后續(xù)分離產(chǎn)生影響，提高了分離樣品的回收率。這種方法的關(guān)鍵之處在于合適的溶劑系統(tǒng)的選擇和配比。 3.4 重結(jié)晶 重結(jié)晶是利用固體混合物中目標組分在某種溶劑中溶解度隨溫度變化的明顯差異，在較高溫度下溶解度大，降低溫度時溶解度小，從而實現(xiàn)分離提純。二氫楊梅素是極性化合物，在其水提物中，不可避免地含有單寧質(zhì)、蛋白質(zhì)、糖類、鹽類以及色素等雜質(zhì)，這些雜質(zhì)以結(jié)合態(tài)或游離態(tài)形式與二氫楊梅素共存，需經(jīng)過多次重結(jié)晶除去雜質(zhì)。二氫楊梅素在熱水中的溶解量約為在冷水中的30倍，而且采用水加熱重結(jié)晶提純法具有操作簡便、安全、廉價的特點。嚴贊開等采用雙溶劑法重結(jié)晶，用38倍的無水乙醇溶解粗提物，用少量活性炭脫色，趁熱過濾后蒸出大部分乙醇，將殘留液倒入4倍的水中，陳化結(jié)晶，經(jīng)2次重結(jié)晶，二氫楊梅素的含量從50.0％提升到90.0％以上。 3.5 大孔吸附樹脂吸附法 大孔吸附樹脂是一種不含交換基團的、具有大孔結(jié)構(gòu)的高分子吸附劑，是一種親脂性物質(zhì)。通過有選擇地吸附有效成分，經(jīng)洗脫回收，除掉雜質(zhì)的一種純化精制的方法，工藝簡單，操作方便，能耗少；操作條件溫和，避免了有效成分失活，而且無毒、無污染；樹脂容易回收再生，可反復(fù)利用，提取效率高。張友勝等采用“增溫溶解，保溫過柱，溫水解吸”的方法對顯齒蛇葡萄中的二氫楊梅素進行提制研究。提純二氫楊梅素時，用單位數(shù)量的D-16大孔吸附樹脂處理料液，結(jié)果表明：該方法的適宜溫度為50～70 ℃，最好為60 ℃，該方法能很好地將70%左右的二氫楊梅素提純到80%；過柱時上柱料液濃度、過柱速度以及解吸時水的流速對二氫楊梅素的提制均有影響。但該法缺點為樹脂用量過大，只適合于小批量不適合工業(yè)生產(chǎn)。 4 含量測定法 4.1 薄層掃描法 薄層掃描法系指用一定波長的光照射在薄層板上，對薄層色譜中有紫外或可見吸收的斑點或經(jīng)照射能激發(fā)產(chǎn)生熒光的斑點進行掃描，將掃描得到的圖譜及積分值用于藥品的質(zhì)量檢查的方法。與高效液相色譜法相比，具有多通道效應(yīng)，可同時平行分離分析多個樣品；流動相用量少且選擇范圍寬、更換方便；固定相為一次性使用，對樣品的預(yù)處理要求不高等優(yōu)點。何桂霞等采用薄層掃描法測定藤茶中二氫楊梅素的含量，用定量毛細管吸取供試品溶液1 μl，對照品溶液2 μl，分別點樣于硅膠G-CMC-Na薄層板（105 ℃活化0.5 h）上，以甲苯-乙 酸乙酯-甲酸（10∶8∶5）為展開劑展開，展距15 cm，用3% FeCl3乙醇溶液噴霧，顯色后，覆蓋相同大小的玻璃板，四周用透明膠紙密封。二氫楊梅素斑點呈紫色，測定藤茶中二氫楊梅素的含量為 38.17%～38.54%，該法快速、簡單、穩(wěn)定，測定結(jié)果準確、可靠。 4.2 高效液相色譜法 高效液相色譜分離技術(shù)是將流動相由高壓泵打入系統(tǒng)，樣品溶液經(jīng)進樣器進人流動相，被流動相載入色譜柱（固定相）內(nèi)，由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù)，在兩相中作相對運動時，經(jīng)過反復(fù)多次吸附-解吸的分配過程，各組分在移動速度上產(chǎn)生較大的差別，被分離成單個組分依次從柱內(nèi)流出，達到組分分離的目的。高效液相色譜分離技術(shù)具有分離速度快、效率高的優(yōu)點。何桂霞等用HPLC法對不同產(chǎn)地不同采收期藤茶葉、莖中的二氫楊梅素進行含量測定，用Nova-PakC18色譜柱（150.0 mm×4.6 mm，5 μm），甲醇：水：磷酸（27.0∶73.0∶0.1）為流動相，流速為1.0 ml/min；紫外檢測波長為290 nm，進樣量20 μl，柱溫25℃，保留時間為9.56 min，線性關(guān)系良好，平均加樣回收率為99.47％，RSD為1.68％，并分離得到二氫楊梅素純品；且證實 5 月份藤茶中二氫楊梅素含量最高27.8％~31.2％，葉中含量高于莖中3~4倍。田森林等采用反相高效液相色譜法測定顯齒蛇葡萄植株中不同部位的二氫楊梅素的含量，用 Nova-PakC18不銹鋼柱，檢測波長為294 nm，用甲醇-水（體積比24∶76）為流動相，變異系數(shù)為1.125%，平均回收率為95.03%，最低檢測量為10 ng。 5 藥理作用 5.1 抗脂質(zhì)過氧化 何桂霞等研究表明：DMY 能抑制離體大鼠腦、心、肝勻漿及線粒體脂質(zhì)過氧化并表現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系；DMY對正常離體大鼠臟器組織過氧化脂質(zhì)的生成均有極顯著的抑制作用，并隨劑量增加作用增強，而且對肝臟的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的抑制作用最強，這可能與肝臟具有物質(zhì)代謝等多種功能的組織結(jié)構(gòu)有關(guān)（如肝臟富含線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體，分別與肝細胞進行功能活動的能量提供、蛋白質(zhì)合成和糖原合成密切相關(guān)）；線粒體腫脹程度與線粒體的生理和病理性反應(yīng)有關(guān)，過度的腫脹則是線粒體損傷的表現(xiàn)。線粒體膨脹與脂質(zhì)過氧化有關(guān)。脂質(zhì)過氧化導(dǎo)致線粒體膜脂質(zhì)及蛋白質(zhì)組分改變，進一步改變膜的屏障功能，引起線粒體呼吸狀態(tài)的改變，使線粒體懸液下降。DMY具有抑制脂質(zhì)過氧化，保護線粒體結(jié)構(gòu)的作用；DMY 對Fe2+-Cys 體系，H2O2-Fe2+體系，Vit C-Fe2+體系誘導(dǎo)心、肝、腦線粒體MDA的生成均有抑制作用，且呈明顯的量效關(guān)系。 5.2 抑菌 DMY對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門菌、大腸埃希軍菌、產(chǎn)氣桿菌、啤酒酵母、黏紅酵母、青霉、黑曲霉、毛霉及根霉對枯草芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、甲型溶血型鏈球菌、乙型溶血型鏈球菌、肺炎雙球菌、白色鏈球菌等16種細菌均有一定的抑制作用；尤其對革蘭陽性、革蘭陰性球菌或桿菌作用明顯；二氫楊梅素對金黃色葡萄球菌，沙門菌，大腸埃希桿菌，產(chǎn)氣桿菌的最低抑菌濃度（MIC）均為0.625 mg/ml，最低殺菌濃度（MBC）分別為0.625、0.625、1.25、1.25 mg/ml；對枯草芽孢桿菌無殺菌作用；二氫楊梅素（含量90％）對牛奶酸敗混合菌群和真菌具有明顯的抑制作用，并隨著年度增加而抑菌作用增強。在pH7.0時，純度為99.5％的二氫楊梅素對金黃色葡萄球菌，大腸埃希菌和銅綠假單胞菌標準株的MIC分別為0.23，1.80，0.90 mg/ml，MBC分別為0.45，1.80，1.80 mg/ml；對金黃色葡萄球菌，大腸埃希菌和白假絲酵母菌臨床分離株的MIC分別為0.06，1.80，0.90mg/ml；MBC 分別為 0.11，1.80，1.80 mg/ml。從顯齒蛇葡萄中分離的DMY對金黃色葡萄球菌和乙型溶血性鏈球菌標準株，乙型溶血性鏈球菌臨床分離株，肺炎鏈球菌，流感嗜血桿菌有抑菌作用，MIC均為0.63 mg/ml。 5.3 抗高血壓 周天達等證實二氫楊梅素能拮抗去甲腎上腺素（NE）和高K+所致的兔胸主動脈條收縮，顯示雙氫楊梅樹皮素對腸平滑肌和主動脈條的α受體具阻斷作用；并進一步證實，二氫楊梅素對NE所引起的依賴內(nèi)Ca2+釋放的收縮有明顯的抑制作用，對NE依602賴細胞外Ca 2+性收縮僅在較高濃度時才顯示抑制作用，提示雙氫楊梅樹皮素對電壓依賴性鈣通道（PDC）有選擇性阻滯作用，有望開發(fā)為抗高血壓藥。 5.4 保肝護肝 DMY能顯著地抑制CCl4、D-Gla和ANIT所致急性肝損傷小鼠血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）和總膽紅素（T-BIL）的升高，減輕肝組織的病理損害程度，降低CCl4所致小鼠肝中MDA生成量，提高SOD活力，明顯抑制血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）活性升高。DMY 0.05、0.10 g/kg灌胃7 d能明顯降低四 氯化碳急性肝損傷小鼠血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）活性；明顯降D-半乳糖胺急性肝損傷小鼠血清ALT、AST活性和總膽紅素（T-BIL）含量；明顯降低異硫氰酸萘酯急性肝損傷小鼠血清 ALT 活性和 T-BIL 含量。DMY 0.1、0.3、0.6 g/kg灌胃7～8 d，對四氯化碳和D-半乳糖所致急性肝損傷小鼠血清ALT和AST均有明顯的降低作用，并隨DMY劑量的增加而增強。含0.1%DMY飼料喂養(yǎng)大鼠，能明顯抑制D-半乳糖胺肝損傷大鼠血清ALT、AST、乳酸脫氫酶（LDH）、α-生育酚水平和谷胱甘肽與氧化型谷胱甘肽的比值的升高；DMY對體外培養(yǎng)的大鼠肝細胞四氯化碳中毒性損傷、D-半乳糖胺和脂多糖誘導(dǎo)的小鼠肝損傷有顯著的保護作用。 5.5 抗癌 DMY濃度為20、40、80 μmol/L時，能抑制體外培養(yǎng)的小鼠B16黑色素瘤細胞對重組細胞基底膜的侵襲，侵襲抑制率分別為36.1%、59.6%、79.1%；同時抑制B16瘤細胞的運動能力，運動能力抑制率分別為51.6%、56.5%、66.8%；降低B16瘤細胞對層黏連蛋白、纖維黏連蛋白和重組細胞基底膜的黏附，降低瘤細胞黏附的效應(yīng)與DMY濃度呈正相關(guān)。DMY150、200 mg/ml含藥小鼠血清對B16黑色素瘤細胞增殖有抑制作用，能阻斷細胞的DNA合成和復(fù)制而產(chǎn)生抑癌作用。DMY100、200、250 mg/kg給每只尾靜脈注射2×105 個B16黑色素瘤細胞的小鼠灌胃18 d，能明顯抑制小鼠B16黑色素瘤細胞肺轉(zhuǎn)移灶，抑制率分別為31.0%、40.6%、61.2%。DMY濃度為0.8～500 μmol/L時，對體外培養(yǎng)的小鼠B16黑 色 素 瘤 細 胞 的 抑 制 達 27.8% ～78.9%。DMY100、50、25、12.5、6.25μg/ml對肝癌Bel-7402白血病細胞HL-60和K562 細胞的體外抑制率IC50值分別為 18.65、12.41 和 18.39 μg/ml。DMY 用MTT法、細胞生長曲線法和集落形成法對體外培養(yǎng)的SGC-7901細胞生長有抑制作用。從粵蛇葡萄中分離的DMY對酪氨酸酶活性呈競爭性抑制，IC50為 0.208 mmol/L，Ki 值為 0.082 mmol/L。DMY 抑制黑色素瘤細胞增殖的機制可能是抑制酪氨酸酶活性。DMY對HK-1人鼻咽癌細胞株和MCF-7乳腺癌細胞株有明顯的抑制作用，隨DMY濃度增加而抑癌作用增強，IC50分別為50.0、79.4 μg/ml。DMY對HL-60、K562白血病細胞株和Bel-7402肝癌細胞株有明顯的抑制作用，隨DMY濃度增加而抑癌作用增強，IC50分別為12.4、18.4、18.6 μg/ml；DMY的乙�；飳θ丝谇话㎏B細胞株、雜交瘤1A9細胞株和人乳腺癌MCF-7細胞株有很強的選擇性細胞毒作用，對抗KB、1A9和MCF-7的DEso分別為0.6、0.7、2.0 mol/ml。 隨著新藥研究的逐步深入，一些研究者將目光轉(zhuǎn)向了民間習(xí)用藥物的開發(fā)。從蛇葡萄屬植物的長期應(yīng)用和藥理研究中發(fā)現(xiàn)，該屬藤茶中二氫楊梅素具有顯著的抗炎、保肝、抗高血壓等多方面作用，但主要藥效學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)不甚清楚，作用機理還不十分明確。我國的二氫楊梅素資源豐富、來源廣泛，具有很高的開發(fā)利用價值。已有的研究表明，二氫楊梅素具有多種生物活性，具有廣闊的應(yīng)用前景。 |
