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[摘　要]　目的:觀察長(zhǎng)期服用厚樸甲醇提取物對(duì)小鼠腎臟的損害作用。方法:厚樸提取物混懸液0.5 ml/鼠(相當(dāng)于原藥材0.25 g)給小鼠灌胃,每天1次,于給藥后0、1、2、3個(gè)月時(shí)稱體重;用RP-HPLC法測(cè)定24 h尿、血、腎臟厚樸酚、和厚樸酚量;檢查腎功能指標(biāo)并行腎組織病理學(xué)檢查。另設(shè)生理鹽水、空白混懸液對(duì)照組。結(jié)果:小鼠體重未見明顯改變,藥物在腎臟排出的半衰期增加1 h以上,血清肌酐、尿素氮和補(bǔ)體3及尿蛋白均增加,病理學(xué)檢查有明顯病理改變。結(jié)論:長(zhǎng)期服用厚樸對(duì)小鼠腎臟具有損害作用,腎損害程度與鼠體內(nèi)厚樸酚、和厚樸酚的濃度呈正相關(guān)。

[關(guān)鍵詞]　厚樸;厚樸酚;和厚樸酚;腎損害

　厚樸為木蘭科植物厚樸(Mangnolia officinalis Rehd.et Wils.)或凹葉厚樸(Mangnolia officinalis Rehd.et Wils.var.biloba Rehd.et Wils.)的干皮、根皮及枝皮,主要成分為厚樸酚(magnolol)、和厚樸酚(honokiol)及四氫厚樸酚、異厚樸酚等,藥理作用和臨床應(yīng)用廣泛。近年臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn),長(zhǎng)期(30 d以上,劑量不等,一般在每天5～10 g原藥)應(yīng)用含厚樸制劑或藥方的病人發(fā)生腎臟可逆性損害,其發(fā)生率和損害程度明顯高于不用或短期應(yīng)用者。本文觀察了小鼠長(zhǎng)期給厚樸提取物后腎臟的損害過程和程度,為探索厚樸制劑致病人腎損害的原因?qū)ふ覍?shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料和方法

1.1　儀器和試藥　高效液相色譜系統(tǒng):510泵、490E檢測(cè)器、Baseline 810工作站(Waters公司);4mm×250 mm色譜柱及預(yù)柱(中科院大連化學(xué)物理研究所);AT-130柱控溫系統(tǒng)(天津金洲科學(xué)儀器公司)。厚樸酚、和厚樸酚對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所);川厚樸(山東省醫(yī)藥公司);有關(guān)試劑為色譜純和分析純。

1.2　動(dòng)物　成年昆明種小鼠(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院試驗(yàn)動(dòng)物中心),♀♂兼用、分籠飼養(yǎng),平均體重(20.1±3.2) g,實(shí)驗(yàn)期間正常飲食和飲水。

1.3　方法

1.3.1　制備厚樸制劑　取川厚樸50 g,粉碎后用甲醇浸泡24 h×2次,合并浸出液,濾清后50℃水浴中減壓濃縮,流浸膏用淀粉吸收后搓成顆粒,晾干,研磨成細(xì)粉,按重量10∶1加CMC-Na,研勻,以乙醇-水(1∶5)為溶媒制成混懸液100 ml,每1 ml相當(dāng)于原藥材0.5 g,用RP-HPLC法測(cè)定含量,厚樸酚12.15 mg/ml,和厚樸酚4.11 mg/ml。同時(shí)制備不含厚樸甲醇浸出物的空白混懸液。

1.3.2　RP-HPLC條件[2,3]　柱填料Spherisorb C18(10μm),預(yù)柱填料YWG C18;流動(dòng)相甲醇-水-冰醋酸(70∶30∶1),流速1.2 ml/min;檢測(cè)波長(zhǎng)294nm,靈敏度0.005 AUFS;柱溫40℃。

1.3.3　分組與給藥方法　取3組小鼠,采用等容積法(0.5 ml·次-1·d-1)分別每日晨空腹灌胃生理鹽水、空白混懸液或川厚樸提取物混懸液0.5 ml(相當(dāng)于原藥材0.25 g),每天1次,分別于單次給藥后、連續(xù)給藥1、2和3個(gè)月時(shí)稱體重并收集24 h尿,經(jīng)眼眶靜脈取血,然后處死小鼠取出腎臟(每組隨機(jī)取10只,♀♂各半)備用。同時(shí)另取兩組對(duì)照組小鼠,與給藥組一起進(jìn)行相應(yīng)處置。

1.4　樣品處理與測(cè)定　尿:記錄24 h各時(shí)間段尿液體積和總體積后,取樣2 ml,加入30%三氯乙酸溶液0.1 ml,離心沉淀蛋白質(zhì)后取上清液測(cè)定厚樸酚、和厚樸酚含量;另取尿液測(cè)定有關(guān)腎臟功能生化指標(biāo)。血清:取眼眶血,待凝后4 000 r/min離心10min,分離血清0.5 ml,加入甲醇0.5 ml沉淀蛋白質(zhì),離心,精取上清液0.5 ml,加入0.1 mol/L的冰醋酸溶液0.1 ml,搖勻,用乙酸乙酯-乙醚混合液(1∶1)2 ml萃取,離心后取有機(jī)相1 ml置尖底試管中,45℃水浴中冷氮?dú)饬鞔蹈?加入流動(dòng)相0.1 ml溶解后進(jìn)樣20μl,測(cè)定厚樸酚、和厚樸酚含量;另取血樣測(cè)定有關(guān)腎臟功能生化指標(biāo)。腎:按2 ml/g組織加入生理鹽水制成勻漿,后處理方法同血清。用RP-HPLC法測(cè)定腎組織中厚樸酚、和厚樸酚含量,并行病理學(xué)檢查。

2　結(jié)　果

2.1　RP-HPLC法測(cè)定結(jié)果　待測(cè)樣品的色譜行為良好,與生物性雜質(zhì)實(shí)現(xiàn)完全分離,厚樸酚、和厚樸酚的保留時(shí)間分別為6.43和8.44 min。尿、血清和腎樣品中厚樸酚在0.05～2 mg/L、和厚樸酚在0.025～1 mg/L濃度范圍內(nèi)與色譜峰面積線性關(guān)系良好。同一濃度樣品連續(xù)測(cè)定5次的日內(nèi)RSD均<5%、連續(xù)測(cè)定5 d的日間RSD<7%,平均加樣回收率>90%。厚樸酚、和厚樸酚的最低檢測(cè)濃度在血、尿樣中分別為0.01和0.008 mg/L。

2.2　體重變化　長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)給藥后,小鼠體重與對(duì)照組相比未見明顯變化(P>0.05),但體重增長(zhǎng)速度略慢,結(jié)果見表1。

2.3　體液中藥物含量與動(dòng)力學(xué)參數(shù)變化　長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)給藥后,厚樸酚、和厚樸酚的血藥濃度均隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加,表明藥物在體內(nèi)有蓄積現(xiàn)象;24 h尿藥濃度則逐漸下降,說明尿中排出減少;而腎組織中蓄積量亦呈逐漸增加趨勢(shì),結(jié)果見表2。各時(shí)間段尿藥濃度用3P87藥動(dòng)學(xué)程序擬合,主要尿藥動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表3。兩種藥物在大鼠體內(nèi)代謝均符合一級(jí)消除動(dòng)力學(xué)二室開放模型,藥物在腎臟的排出半衰期增加了1 h以上。

2.4　腎臟功能生化指標(biāo)變化　連續(xù)給藥后,血清肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、白蛋白和補(bǔ)體3(C3)均呈增加趨勢(shì),補(bǔ)體4(C4)未見明顯改變。24 h尿蛋白增加明顯,空白混懸液和生理鹽水組相應(yīng)值沒有增加,可以說明腎臟功能變化應(yīng)是由厚樸所引起。結(jié)果見表4。

2.5　腎臟細(xì)胞結(jié)構(gòu)病理學(xué)變化　結(jié)果見圖1�？梢姽辔干�理鹽水3個(gè)月后腎組織呈正常結(jié)構(gòu),空白混懸液組3個(gè)月后腎小球有輕度腫脹、腎小管上皮細(xì)胞正常、球囊稍擴(kuò)大、腎小管內(nèi)可見少量炎性滲出,應(yīng)為混懸液中所含乙醇所致;厚樸灌胃1個(gè)月后,腎小球輕度腫脹,腎小管(右上方)上皮腫脹、腎小管輕度擴(kuò)張、部分腎小管內(nèi)可見沉積物;3個(gè)月后腎小球腫脹、呈網(wǎng)狀、結(jié)構(gòu)消失,腎小球內(nèi)可見少量沉積物,腎小管上皮多呈立方狀結(jié)構(gòu)。

3　討　論

厚樸是一味傳統(tǒng)中藥,應(yīng)用廣泛�！吨腥A人民共和國(guó)藥典》2000年版記述其歸脾、肺、大腸經(jīng),有關(guān)傳統(tǒng)著述尚未見對(duì)腎臟正負(fù)面作用的記載。據(jù)該藥物出口東南亞國(guó)家反饋信息“長(zhǎng)期使用本藥的病人腎功能有不同程度損害”。調(diào)查本院臨床,確有此損害發(fā)生,但為可逆性損害。本實(shí)驗(yàn)研究表明,小鼠長(zhǎng)期口服厚樸提取物(主要成分為厚樸酚、和厚樸酚)確實(shí)存在腎臟的損害,包括血清Cr和BUN等指標(biāo)的明顯變化和光鏡下組織學(xué)的改變,組織學(xué)改變情況與IgA腎病模型相似,如腎小球內(nèi)沉淀主要在系膜區(qū)呈顆�；驁F(tuán)塊狀,腎小球腫大,并有炎細(xì)胞浸潤(rùn)。臨床含厚樸方主要用于消化系疾病,一般用量為5～10 g(中華人民共和國(guó)藥典2000年版載用量為3～9 g)。按照人標(biāo)準(zhǔn)體重70 kg、小鼠20 g,設(shè)計(jì)每只小鼠給藥劑量為每次相當(dāng)于原藥材150、200和250 mg的提取液。預(yù)實(shí)驗(yàn)表明小鼠對(duì)最大劑量耐受性良好,并且給予這個(gè)劑量時(shí)血、尿中厚樸酚、和厚樸酚濃度方能同時(shí)測(cè)定,故選擇250 mg作為單次給藥劑量。因本實(shí)驗(yàn)旨在初步觀察長(zhǎng)期給藥后腎損害的現(xiàn)象,應(yīng)觀察在連續(xù)給藥過程中的累積毒性,故設(shè)計(jì)了1、2、3個(gè)月的給藥療程詳細(xì)的劑量-損害、時(shí)間-損害、不同周齡動(dòng)物、不同種類動(dòng)物的腎損害,對(duì)抗這種損害的藥物或活性化合物的篩選實(shí)驗(yàn)仍在進(jìn)行中。

本文對(duì)厚樸酚、和厚樸酚動(dòng)物體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究發(fā)現(xiàn),藥物的生物利用度很低,大部分藥物經(jīng)腸道排泄,腎臟排泄率只有30%左右。雖然如此,但是本實(shí)驗(yàn)表明,長(zhǎng)期給藥后在腎臟有蓄積中毒作用,體內(nèi)藥物濃度升高,消除半衰期延長(zhǎng),但對(duì)厚樸長(zhǎng)期應(yīng)用后的腎臟損害機(jī)制尚不明,有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。綜合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,長(zhǎng)期應(yīng)用厚樸對(duì)腎臟確有損害作用,提示臨床應(yīng)用該藥物時(shí),應(yīng)盡量減少使用時(shí)間。如必需長(zhǎng)期應(yīng)用,則應(yīng)定期檢查腎功能,或者與腎功能保護(hù)藥物聯(lián)用。

厚樸酚、和厚樸酚為同分異構(gòu)體,分子中均有兩個(gè)酚羥基,含厚樸制劑中的厚樸酚、和厚樸酚HPLC測(cè)定法一般在常溫下用甲醇+水或乙腈+水作流動(dòng)相,藥物保留時(shí)間過長(zhǎng),完成一次測(cè)定需時(shí)15～20 min,本實(shí)驗(yàn)在流動(dòng)相中加入冰醋酸調(diào)節(jié)pH,使藥物呈完整的分子狀態(tài),加上使柱溫升高,藥物保留時(shí)間縮短,完成一次測(cè)定只需10 min。