摘要 采用硅膠柱色譜和重結(jié)晶的方法制備姜黃素標(biāo)準(zhǔn)樣品，用 UV，IR，MS 和 NMR 等方法對姜黃素標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，并進(jìn)行了均勻性、穩(wěn)定性檢驗(yàn)。采用國內(nèi) 8 家具有分析資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行協(xié)同定值，并對定值結(jié)果的不確定度進(jìn)行了評定。姜黃素標(biāo)準(zhǔn)樣品的定值結(jié)果為 99.78%，置信度 95% 的擴(kuò)展不確定度 (k=2) 為 0.13%。該姜黃素標(biāo)準(zhǔn)樣品可用于有關(guān)姜黃素檢測方法的校正和相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量控制。
Preparation of Certified Referrence Materials of Curcumin
Wang Daijie1， Zhou Xiaojing2， Li Qiang1， Geng Yanling1， Yu Jinqian1， Chen Jingxian1， Wang Xiao1， Dan Staerk1
(1. Shandong Academy of Sciences， Shandong Analysis and Test Center， Jinan 250014, China;2. Beijing Center for Physical and Chemical Analysis， Beijing 100089， China)
Abstract Curcumin certified reference material was separated by silica gel column chromatography andrecrystallization method. Its chemical structure was identified by UV，IR，MS and NMR. The homogeneity and stabilitywere systematic checked. A cooperative certification was conducted with 8 qualified laboratories. The results showed thatthe certified value of the reference material of curcumin was 99.78% with the expanded uncertainty of 0.13% (k=2) inconfidence coefficient of 95%. The reference material of curcumin can conform to the technical requirement of the certifiedreference material. The materials can be used for method validation and quality control of regarding products.
Krywoeds curcumin; certified reference material; homogeneity; stability; certification; uncertainty
姜黃是我國常用大宗藥材，為姜科植物姜黃(Curcuma longa L.) 的干燥根莖，在我國臺(tái)灣、福建、廣東、廣西、云南等省區(qū)廣泛分布，具有破血行氣，通經(jīng)止痛的功效，用于胸脅刺痛、胸痹心痛、痛經(jīng)經(jīng)閉、癥瘕、風(fēng)濕肩臂疼痛、跌撲腫痛等病癥［1］�，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，姜黃具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗血小板凝集、抗腫瘤、抗菌、保肝、降糖降血脂等作用［2–7］。姜黃作為藥食同源藥材，市場前景廣闊，2006 年姜黃被 WHO制定的《藥用植物 WHO 手冊》收錄；同時(shí)歐盟、美國、加拿大等國家地區(qū)均將姜黃及其相關(guān)提取物列為食品添加劑進(jìn)行管理，日本把姜黃、姜黃提取物作為保健食品使用。姜黃素 ( 化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖 1) 為橙黃色粉末，是我國藥典規(guī)定的姜黃藥材的高效液相色譜檢測指標(biāo)。姜黃素在食品生產(chǎn)中廣泛用于腸類制品、罐頭、醬鹵制品等產(chǎn)品的著色，因此需要嚴(yán)格控制姜黃素的質(zhì)量以保證食品的安全性。
目前我國尚無姜黃素標(biāo)準(zhǔn)樣品。為了滿足姜黃藥材、成藥分析檢測及質(zhì)量控制工作的需求，保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性、可比性和溯源性，急需制備姜黃素標(biāo)準(zhǔn)樣品。為此筆者采用硅膠柱色譜和重結(jié)晶的方法研制了姜黃素標(biāo)準(zhǔn)樣品。
圖 1姜黃素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式
1實(shí)驗(yàn)部分
1．1主要儀器與試劑
旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：R–3 型，瑞士 BUCHI 公司；
高效液相色譜儀：1260 型，美國 Agilent 公司；
液質(zhì)聯(lián)用儀：6520 Q–ToF 型，美國 Agilent 公司；
紫外可見分光光度計(jì)：UV–2550 型，日本島津公司；
核磁共振波譜儀：INOVA 600 型，美國 Varian公司；
全自動(dòng)元素分析儀：Vario EL Ⅲ 型，德國ELEMENTAR 公司；
數(shù)字熔點(diǎn)儀：WRS–1B 型，上海精密科學(xué)儀器有限公司；
冷凍干燥儀：SCIENTZ–10N 型，寧波新芝生物科技股份有限公司；
薄層硅膠板 GF254 ：青島海洋化工廠；
硅膠：G 75～150 μm (100～200 目 )，青島海洋化工廠；
硅膠：G 49～75 μm (200～300 目 )，青島海洋化工廠；
氯仿、乙酸乙酯、甲醇、丙酮：分析純，天津市廣成化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水；
姜黃藥材：購自濟(jì)南建聯(lián)中藥店，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)鑒定為姜科植物姜黃 (Curcuma longa L.) 的正品藥材。
1．2姜黃素標(biāo)準(zhǔn)樣品制備
將姜黃藥材粉碎，置于圓底燒瓶中，用石油醚回流提取 3 次，每次 3 h，濾過。濾渣用丙酮回流提取3次，每次3h，濾過，得丙酮提取物，即姜黃素類總成分。將提取物反復(fù)經(jīng)硅膠柱色譜分離，氯仿／甲醇梯度洗脫，薄層色譜跟蹤監(jiān)測，收集含姜黃素組分。將收集到含姜黃素較純部分放置在通風(fēng)櫥內(nèi)，以乙酸乙酯重結(jié)晶，過濾并干燥。
1．3純度分析方法
采用等度HPLC，梯度 HPLC、薄層色譜、HPLC–MS 等多種方法對所制備的姜黃素樣品進(jìn)行純度檢驗(yàn)。
1.3.1 等度 HPLC 分析條件
色譜柱：C18 (250 mm×4.6 mm，5 μm) ；
流動(dòng)相：乙腈 –0.5% 甲酸水溶液 ( 體積比 48∶52)，流速為 1.0mL／min ；柱溫：30℃；運(yùn)行時(shí)間：30 min ；檢測波長：430 nm。
1.3.2 梯度 HPLC 分析條件
色譜柱：C18 (250 mm×4.6 mm，5 μm) ；流動(dòng)相：A 為乙腈，B 為 0.5% 甲酸水溶液；梯度洗脫條件：0～20 min，48%A，20～40 min，48%A～100%A，40～50 min，100%A，流 速 為 1.0 mL／min ；柱 溫：30℃；運(yùn)行時(shí)間：50 min ；檢測波長：430 nm。
1.3.3 薄層色譜條件
硅膠板：GF254 ；梯度點(diǎn)樣 (20，40，60，80，100μg) ；展開系統(tǒng)：正己烷 – 乙酸乙酯 ( 體積比 1∶1)、
氯仿 – 甲醇 – 甲酸 ( 體積比 10∶1∶1) ；檢測方法：熒光檢測、日光檢測。
1.3.4 MS 分析條件
ESI電噴霧離子源；毛細(xì)管電壓：4.0 kV ；載氣：普氮，流速為 10 L／min，溫度為 300℃；掃描范圍(m／z) ：100~1 000。
1．4結(jié)構(gòu)鑒定
采用 UV，IR，MS，NMR 等方法對姜黃素進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。
2結(jié)果與討論
2．1純度分析
分別采用等度和梯度 HPLC 對姜黃素樣品進(jìn)行洗脫，用 DAD 檢測器進(jìn)行 3D 掃描，扣除溶劑峰，掃描色譜圖未見明顯雜質(zhì)色譜峰。430 nm 檢測波長下，對姜黃素樣品色譜峰進(jìn)行面積歸一化定量，扣除溶劑峰，等度和梯度 HPLC 所得姜黃素樣品純度分別為 99.89% 和 99.85%。從薄層色譜圖看，正己烷–乙酸乙酯(體積比1∶1)和氯仿–甲醇–甲酸(體積比10∶1∶1)展開體系的Rf值分別為0.85和0.64，熒光檢測和日光檢測未見明顯雜質(zhì)。通過考察姜黃素正離子模式和負(fù)離子模式的總離子流圖，未見明顯雜質(zhì)峰。
2．2結(jié)構(gòu)鑒定
采用 UV，IR，MS 和 NMR 等方法對姜黃素進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，數(shù)據(jù)如下。UVmax EtOHm ：264.2，429.2 nm ；IRVcmmax1-：3 392 (νOH)，1628(νC=O)，1 601 (νC=C)，1 428 (δCH)，1 282 (νCO)；ESI–MS：m／z 369.1337 ［M+H］+，391.1150 ［M+Na］+，759.2406［2M+Na］+，306.1885 ［M–H］–。1H 和13C–NMR 數(shù)據(jù)見表 1，表 2。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［12–14］比較，確定制得的樣品為姜黃素。
2．3均勻性檢驗(yàn)
按 照“GB／T 15000.3–2008／ISO Guide 35 ：2006 標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則 (3) 標(biāo)準(zhǔn)樣品定值的一般原則和統(tǒng)計(jì)方法 (7 均勻性研究 )”要求，采用隨機(jī)順序重復(fù)測量的方法，從分裝后的樣品中隨機(jī)抽取 10 瓶樣品，按 3 種次序 ( 第 1 組：1–3–5–7–9–2–4–6–8–10 ；第 2 組：10–9–8–7–6–5–4–3–2–1 ；第3 組：2–4–6–8–10–1–3–5–7–9) 進(jìn)行測定。分別從每瓶中稱取 0.2 mg 樣品 3 份，每份樣品分別用 1.0mL 甲醇 ( 色譜純）溶解，按 1.4 等度 HPLC 分析，以面積百分比讀取樣品的純度值。檢測數(shù)據(jù)用方差分析法進(jìn)行分析。以 F 檢驗(yàn)，確定姜黃素標(biāo)準(zhǔn)樣品的均勻性數(shù)據(jù)是否附合正態(tài)分布。檢驗(yàn)結(jié)果見表 3～表 5。
瓶間方差用下式計(jì)算：
均勻性引入的不確定度：
u均=sbb=4.44×10–5
由表 5 可知，υ1=9，υ2=20，查 F 臨界值表得，因此研制的姜黃素標(biāo)準(zhǔn)本樣品是均勻的。
2．4穩(wěn)定性檢驗(yàn)
將姜黃素樣品于 2～8℃保存，以 2 年為期，對制備的姜黃素樣品每 6 個(gè)月取樣檢驗(yàn)，按 1.4 等度HPLC 分析，以面積百分比讀取樣品的純度值，每份試樣以測定 5 次的平均值為其定值結(jié)果，用 t 檢驗(yàn)對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析［8］，穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果見表 6。
用 t 檢驗(yàn)對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用直線作為經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ停^察斜率值是否有顯著變化，以此對標(biāo)準(zhǔn)樣品的穩(wěn)定性變化進(jìn)行預(yù)測。斜率按下式計(jì)算：
因此斜率的變化不顯著，即姜黃素標(biāo)準(zhǔn)樣品在2 年內(nèi)未觀測到明顯的不穩(wěn)定性。
穩(wěn)定性引入的不確定度：
u穩(wěn)=s(b1)t=0.017%×24=4.08×10–3
2．5定值
按照標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則，采用多個(gè)實(shí)驗(yàn)室協(xié)作定值，參加實(shí)驗(yàn)室的數(shù)目為 8 個(gè)［8–11］。隨機(jī)抽取 24瓶樣品，每個(gè)定值實(shí)驗(yàn)室送3瓶，每瓶平行測定2次。
定值實(shí)驗(yàn)室將樣品配成一定濃度的溶液，用高效液相色譜儀測定，采用峰面積歸一化法進(jìn)行純度定值。對所采集的測定結(jié)果，采用格拉布斯 (Grubbs) 檢驗(yàn)
法進(jìn)行檢驗(yàn)，未發(fā)現(xiàn)異常值，測定結(jié)果呈正態(tài)分布。依據(jù)高效液相色譜法峰面積歸一法所得全部測定結(jié)果，計(jì)算出姜黃素標(biāo)準(zhǔn)樣品的標(biāo)準(zhǔn)值。定值結(jié)果見表 7。
根據(jù)表 7 數(shù)據(jù)計(jì)算測定測定結(jié)果的總平均值：
實(shí)驗(yàn)室平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差：
總平均值標(biāo)準(zhǔn)偏差：
多家定值引入的不確定度：
u定= sX =0.05%=5.00×10–4
研制的標(biāo)準(zhǔn)樣品定值結(jié)果的不確定度由以下幾部分組成：
(1) 均勻性檢驗(yàn)引入的不確定度；
(2) 穩(wěn)定性檢驗(yàn)引入的不確定度；
(3) 多家定值引入的不確定度。
各不確定度分量互不相關(guān)，因此合成不確定度：
u2=u均2+u穩(wěn)2+u定2
代入數(shù)據(jù)計(jì)算得： u=0.065%在置信概率為 95% 時(shí)，k=2，則擴(kuò)展不確定度U=2u=0.065%×2=0.13%。
3結(jié)論
(1) 針對我國缺少姜黃素國家實(shí)物標(biāo)準(zhǔn)樣品的現(xiàn)狀，對姜黃素標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行研制，建立了姜黃素標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方法。根據(jù) GB／T 15000.3–2008 標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則，對制得姜黃素樣品進(jìn)行了均勻性、穩(wěn)定性及定值研究。
(2) 制備出標(biāo)準(zhǔn)值為 99.78%，擴(kuò)展不確定度(95％置信區(qū)間 ) 為 0.13％的姜黃素標(biāo)準(zhǔn)樣品，該標(biāo)準(zhǔn)樣品符合國家一級標(biāo)準(zhǔn)樣品的技術(shù)規(guī)范要求，填補(bǔ)了國內(nèi)該領(lǐng)域的研究空白。該標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制可滿足姜黃及相關(guān)產(chǎn)品分析檢測、質(zhì)量控制工作的需求，為其檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性、可比性和溯源性提供技術(shù)支撐和量值溯源保證。
參 考 文 獻(xiàn)：
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作者：王岱杰1，周曉晶2，李強(qiáng)1，耿巖玲1，于金倩1，陳靜嫻1，王曉1，Dan Staerk1
(1. 山東省分析測試中心，濟(jì)南 250014 ； 2. 北京理化分析測試中心，北京 100089)
摘自：《化學(xué)分析計(jì)量》
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姜黃素標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制-上禾生物 
