中藥厚樸提取物對人白血病細胞作用初探 | 中藥厚樸提取物對人白血病細胞作用初探 |
| 發(fā)布時間:2013-12-19 信息來源:admin 發(fā)布人:admin 點擊次數(shù):1768 |
[摘要]目的:研究中藥厚樸提取物和厚樸酚與厚樸酚對白血病細胞的增殖抑制和誘導凋亡作用。方法:用MTT、AnnexinV、凋亡DNALadder等實驗,觀察和厚樸酚與厚樸酚對白血病K562、HL-60和U937細胞抑制增殖和誘導凋亡的作用。結(jié)果:和厚樸酚實驗組對K562、HL-60和U937有增殖抑制作用,呈劑量時間依賴性,且對K562、HL-60和U937有誘導凋亡 作用;厚樸酚對HL-60有增殖抑制作用,并呈劑量時間依賴性,但與和厚樸酚聯(lián)合用藥無協(xié)同作用。結(jié)論:和厚樸酚與厚樸酚對白血病細胞株均有增殖抑制作用,且呈劑量時間依賴性,但二者之間無聯(lián)合協(xié)同作用。 [關鍵詞]厚樸;和厚樸酚;厚樸酚;白血病細胞 隨著環(huán)境污染加重,白血病的患病率有上升趨勢。目前白血病臨床治療首選化療。但由于化療藥物的副作用和復發(fā)等問題,使得研發(fā)高效低毒的化療藥物迫在眉睫。研究發(fā)現(xiàn),中藥厚樸提取物和厚樸酚與厚樸酚有抗菌消炎,抗腫瘤等療效。K562細胞株是第一個被分離建立的髓系白血病細胞系,表達BcrAbl融合基因, HL-60是人類幼稚粒細胞白血病細胞系, U937細胞株能分泌大量細胞和趨化因子(IL-1和GM-CSF)等。本研究以白血病K562、HL-60和U937細胞株為研究對象,探討中藥厚樸提取物和厚樸酚與厚樸酚對白血病細胞增殖抑制和誘導凋亡作用,研究中藥抗腫瘤的物質(zhì)基礎和作用機制。 1 材料與方法 1·1 細胞培養(yǎng) K562、HL-60、U937于CO2培養(yǎng)箱中37℃、體積分數(shù)5%的CO2常規(guī)培養(yǎng), 2~3 d換液傳代一次。 1·2 MTT實驗 取各對數(shù)生長期培養(yǎng)細胞計數(shù),再分別取1mL細胞(1×105個細胞)于24孔培養(yǎng)板中。設計6 個系列濃度,即分別依次加入和厚樸酚(終濃度0·0、20·0、40·0、60·0、80·0、100·0μmol/L),置于37℃, CO2培養(yǎng)箱中。分別在24、48、72 h取100μL細胞于96孔細胞培養(yǎng)板,加MTT(上海凌峰化學試劑有限公司,中國。5 mg/mL)10μL混勻,37℃放置4 h。然后,各加異丙醇溶液(V(HCl)∶V(異丙醇)=17∶5 000)100μL,混勻,在Multiskan spectrum酶標儀(Thermo Labsystems公司,美國)570 nm進行檢測,計算并制作抑制率濃度曲線圖。 用同樣的MTT方法觀察厚樸酚終濃度為0·0、10·0、20·0、30·0、40·0、50·0μmol/L作用HL-60 24、48及72 h,以及和厚樸酚、厚樸酚各自終濃度為0·0、6·3、12·5、25·0、50·0、100·0μmol/L聯(lián)合作用HL-60 24、48和72 h,觀察和厚樸酚與厚樸酚之間有無協(xié)同作用。 1·3 DNALadder分析 各取已加和厚樸酚20·0、40·0μmol/L的K562、HL60、U937細胞液適量(1×105個細胞),在37℃, CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,用DNA Ladder提取試劑盒(普利來基因有限公司,中國)提取細胞DNA進行電泳分析,當細胞發(fā)生凋亡時電泳圖譜出現(xiàn)DNA條帶。 1·4 流式細胞術分析 分別在上述K562、HL60、U937加入和厚樸酚終濃度為0·0、20·0、40·0μmol/L培養(yǎng)24 h后,取適量細胞用FITCAnnexinV/PI雙染,進行流式細胞術分析。 1·5 聯(lián)合用藥的聯(lián)合指數(shù)分析 用ChouTalalay公式計算兩藥聯(lián)合作用白血病細胞的聯(lián)合指數(shù)CI(CI=1疊加效應, CI<1協(xié)同,CI>1拮抗)。 1·6 統(tǒng)計學處理 用統(tǒng)計軟件SPSS13·0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。 2 結(jié)果 2·1 和厚樸酚對白血病細胞MTT實驗結(jié)果(圖1) 利用MTT實驗分別觀察和厚樸酚對K562、HL-60和U937增殖抑制作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)和厚樸酚對其均有增殖抑制作用,且呈劑量時間依賴。
2·2 和厚樸酚對白血病細胞DNAladder電泳實驗結(jié)果 本實驗按試劑盒說明書操作。當細胞發(fā)生凋亡時細胞DNA發(fā)生剪切,出現(xiàn)有規(guī)則的DNA片段。0·0、20·0、40·0μmol/L和厚樸酚分別作用K562、HL-60、U937 24 h后,進行DNA ladder電泳分析,在40·0μmol/L泳道出現(xiàn)了均勻的DNA片段條帶。 2·3 和厚樸酚對白血病細胞的流式細胞分析(FITC AnnexinV/PI雙染)實驗結(jié)果(圖2封3)細胞凋亡早期,細胞膜磷脂酰絲氨酸(PS)從細胞膜內(nèi)側(cè)轉(zhuǎn)移到外側(cè),使PS暴露在細胞膜表面與熒光標記AnnexinV特異性結(jié)合,通過流式細胞儀可檢測和分析細胞凋亡數(shù)量。0·0、20·0、40·0μmol/L和厚樸酚分別作用K562、HL-60、U937 24 h后,進行流式細胞術分析。
2·4 厚樸酚及厚樸酚、和厚樸酚聯(lián)合作用對HL-60的MTT實驗結(jié)果(圖3) 利用HL-60首先觀察厚樸的另一種提取化合物厚樸酚對白血病細胞的增殖抑制作用,并通過統(tǒng)計學方法觀察厚樸酚、和厚樸酚聯(lián)合作用的效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)厚樸酚對HL-60也存在增殖抑制作用,但與和厚樸酚之間無聯(lián)合協(xié)同作用,聯(lián)合指數(shù)CI>1。 3 討論 厚樸主要用于治療胃腸功能紊亂,其干燥皮可提取活性藥用成分和厚樸酚及厚樸酚。近年發(fā)現(xiàn)和厚樸酚具有明顯的抗腫瘤活性,可明顯抑制卵巢癌、乳腺癌等多種實體腫瘤增殖作用。中醫(yī)藥臨床多用原藥,原藥厚樸中除含有和厚樸酚,還富含厚樸酚等天然活性化合物,因此我們利用MTT實驗觀察和厚樸酚與厚樸酚對三種白血病的增殖抑制和誘導凋亡作用。凋亡的顯著特征是細胞內(nèi)出現(xiàn)凋亡小體。是由染色體DNA斷裂所致。斷裂后形成了許多長約180 bp倍數(shù)的DNA片斷,通過電泳照相顯示為階梯狀,成為凋亡DNA Ladder,是細胞凋亡經(jīng)典實驗。DNALadder電泳實驗結(jié)果顯示和厚樸酚對三種白血病細胞有誘導凋亡作用。細胞早凋亡時,位于細胞膜內(nèi)側(cè)的PS可遷移至外側(cè),形成膜反轉(zhuǎn)。標記上熒光素的磷脂酰結(jié)合蛋白V(Annexin V)對PS有高度的親合力。圖2顯示當0·0、20·0、40·0μmol/L和厚樸酚分別作用于K562、HL-60、U937 24 h后,通過流式細胞儀檢測到AnnexinV-FITC陽性細胞,顯示和厚樸酚作用白血病細胞后發(fā)生PS膜反轉(zhuǎn),出現(xiàn)早期凋亡細胞,且凋亡細胞數(shù)量具有劑量依賴性。 圖3A提示厚樸酚作用HL-60后其抑制率與和厚樸酚接近。說明和厚樸酚與厚樸酚活性化合物是抗腫瘤的物質(zhì)基礎。圖3B為和厚樸酚與厚樸酚聯(lián)合作用時通過統(tǒng)計學計算得到的聯(lián)合指數(shù),當聯(lián)合厚樸酚對白血病細胞的增殖抑制作用,并通過統(tǒng)計學方法觀察厚樸酚、和厚樸酚聯(lián)合作用的效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)厚樸酚對HL-60也存在增殖抑制作用,但與和厚樸酚之間無聯(lián)合協(xié)同作用,聯(lián)合指數(shù)CI>1。 3 討論 厚樸主要用于治療胃腸功能紊亂,其干燥皮可提取活性藥用成分和厚樸酚及厚樸酚。近年發(fā)現(xiàn)和厚樸酚具有明顯的抗腫瘤活性,可明顯抑制卵巢癌、乳腺癌等多種實體腫瘤增殖作用。中醫(yī)藥臨床多用原藥,原藥厚樸中除含有和厚樸酚,還富含厚樸酚等天然活性化合物,因此我們利用MTT實驗觀察和厚樸酚與厚樸酚對三種白血病的增殖抑制和誘導凋亡作用。凋亡的顯著特征是細胞內(nèi)出現(xiàn)凋亡小體。是由染色體DNA斷裂所致。斷裂后形成了許多長約180 bp倍數(shù)的DNA片斷,通過電泳照相顯示為階梯狀,成為凋亡DNA Ladder,是細胞凋亡經(jīng)典實驗。DNALadder電泳實驗結(jié)果顯示和厚樸酚對三種白血病細胞有誘導凋亡作用。 細胞早期凋亡時,位于細胞膜內(nèi)側(cè)的PS可遷移至外側(cè),形成膜反轉(zhuǎn)。標記上熒光素的磷脂酰結(jié)合蛋白V(Annexin V)對PS有高度的親合力。圖2顯示當0·0、20·0、40·0μmol/L和厚樸酚分別作用于K562、HL-60、U937 24 h后,通過流式細胞儀檢測到AnnexinVFITC陽性細胞,顯示和厚樸酚作用白血病細胞后發(fā)生PS膜反轉(zhuǎn),出現(xiàn)早期凋亡細胞,且凋亡細胞數(shù)量具有劑量依賴性。 圖3A提示厚樸酚作用HL-60后其抑制率與和厚樸酚接近。說明和厚樸酚與厚樸酚活性化合物是抗腫瘤的物質(zhì)基礎。圖3B為和厚樸酚與厚樸酚聯(lián)合作用時通過統(tǒng)計學計算得到的聯(lián)合指數(shù),當聯(lián)合指數(shù)CI<1時表示二者有聯(lián)合作用。和厚樸酚與厚樸酚聯(lián)合作用HL-60在不同時間段聯(lián)合指數(shù)CI>1,提示二者對HL-60無聯(lián)合協(xié)同作用。綜上所述,和厚樸酚與厚樸酚分別具有抑制K562、HL-60和U937增殖抑制或誘導凋亡作用,和厚樸酚與厚樸酚對HL-60的增殖抑制無協(xié)同聯(lián)合作用,其結(jié)果為研發(fā)新的抗白血病治療藥物和厚樸的新用途提供了實驗依據(jù)。 |
