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HPLC法測定Beagle犬血漿中芹菜素的濃度

 芹菜素(apigenin)屬于黃酮類化合物，廣泛存在于水果、 蔬菜、豆類、茶葉中。一，其中芹菜含量最高。車前子、絡(luò)石藤、 藿香等藥用植物中均含有大量芹菜素口一。研究發(fā)現(xiàn)，其有抗癌、抗病毒、抗菌、抗過敏，抗血管脆性和血小板聚集及抗糖 尿病并發(fā)癥等多種生理活性與藥理作用，對人類的腫瘤、衰 老、心血管病等退行性疾病的治療和預(yù)防有重要意義[3 。

 許多研究表明，黃酮類在肝臟二相代謝酶的作用下，可發(fā)生葡萄糖醛酸化和硫酸化反應(yīng)，因此芹菜素在血漿中有部分以葡萄糖醛酸結(jié)合物和硫酸結(jié)合物存在--，導(dǎo)致游離的芹 菜素含量降低，無法準(zhǔn)確測得結(jié)果 。我們將芹菜素靜脈給 藥后的犬血漿樣品經(jīng)葡萄糖醛酸酶及硫酸酯酶水解后發(fā)現(xiàn)，血漿藥物芹菜素濃度顯著高于未水解血漿。因此將含藥血 漿酶解后再進(jìn)行測定，使其葡萄糖醛酸、硫酸酯及其他結(jié)合 物均能水解成游離的單體進(jìn)行測定以考察其濃度更為合理。目前芹菜素的血藥濃度測定和藥代動力學(xué)研究尚在起步階段，動物模型建立不多。本實(shí)驗(yàn)采用酶解法，建立HPI C法 測定Beagle犬血漿中芹菜素濃度，為芹菜素的臨床研究提供參考。

 1 材料

 1．1 儀器HPLC—Agilent 1100(VWD，手動進(jìn)樣器)； ChemStation for LC (Agilent CO．LTD)；XW一80A漩渦}昆合 器(上海精科實(shí)業(yè)有限公司)；Eppendorf Centifuge 5415 R (Eppendorf AG 22331 Hamburg)。

 1．2 試劑 芹菜素對照品(Lot l11K1520，SIGMA— ALDRICH CO．)；8一葡萄糖苷酸酶(IX—A)和硫酸酯酶(H一1) 均購自Sigma公司；甲醇(色譜純)；醋酸銨(分析純)；乙酸乙 酯(分析純)；鹽酸(分析純)；超純水。

 2 方法和結(jié)果

 2．1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil ODS C-8色譜柱(250 mm×4．6 mm，5“m)；流動相：甲醇一O．2 醋酸銨溶液(50： 5O， ／ )；流速：1．0 ml·min_。；紫外檢測波長：336 nm；進(jìn) 樣量：5O“l(fā)；柱溫：25℃ 。色譜圖見圖1。芹菜素保留時(shí)間 9．5 rain，空白血漿色中，雜質(zhì)峰不干擾測定，表明該方法專 屬性好。

 2．2 血樣采集受試Beagle犬(體質(zhì)量l2．0～ 15．0 kg，浙 江大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供)禁食12 h，于后肢靜脈給 芹菜素(60 mg·ml )10 ml。分別于給藥后0、0．2、8．0 h由 前肢取靜脈血約0．5 ml，300×g離心10 min，分離出血漿，冷凍保存。

 2．3 血漿預(yù)處理 精密移取血漿0．3 ml，漩渦震蕩加入 0．23 tool·L 鹽酸30 l，使酸化。加入p葡萄糖苷酸酶(300 U·ml )和硫酸酯酶(15 U ·ml )各5 l，38C水浴振蕩水解1．5 h后，置于冰浴中加入3．0 ml乙酸乙酯，立即密封，旋渦 振蕩5 rain，400×g離心10 rain，精密移取2．0 ml上清液于另一干凈試管中，于真空干燥器中抽干。測定前加流動相200 ttl 溶解，1 000×g離心5 min，取上清液5O l進(jìn)樣。

 2．4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取芹菜素對照品50．0 mg，置5O ml量瓶中，加甲醇溶解稀釋至刻度， 搖勻，即成芹菜素標(biāo)準(zhǔn)儲備液。臨用前以甲醇稀釋成所需濃度的標(biāo)準(zhǔn)液。

 于0．3 ml空白血漿中分別加入系列濃度的芹菜素標(biāo)準(zhǔn) 液，使其血漿藥濃分別為0．673 2、2．681、10．70、21．43、 32．15、42．88“g·ml_。，按2．3項(xiàng)下條件操作。以樣品峰面 積為Y，以血漿芹菜素濃度為x，進(jìn)行線性回歸，其直線方程 y一59．O7x+2．962，r一0．999 7(”一6)。血漿芹菜素最低檢測濃度為0．083 73“g-ml (S／N≥3)。

 2．5 方法學(xué)觀察

 2．5．1 絕對回收率 精密量取芹菜素標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量，加 入空白血漿，配置成芹菜素濃度為0．673 2、1O．7O、42．88 g·ml 的低、中、高濃度的標(biāo)準(zhǔn)血樣溶液各5份，按2．3項(xiàng) 下條件操作，記錄峰面積與對應(yīng)濃度的芹菜素標(biāo)準(zhǔn)溶液所得峰面積之比，得絕對回收率為95．65 ～98．58 。

 2．5．2 加樣回收率 精密量取芹菜素標(biāo)準(zhǔn)儲存液適量，加 入空白血漿，配置成芹菜素濃度為0．673 2、1O．7O、42．88 g·m1 的低、中、高濃度的標(biāo)準(zhǔn)血樣溶液各5份，按2．3項(xiàng) 下條件操作，將峰面積代人標(biāo)準(zhǔn)曲線得到各質(zhì)量濃度測定值，與加入量之比得到加樣回收率為98．98 ～101．9 。

 2．5．3 精密度考察 按加樣回收率項(xiàng)下，配制濃度為 0．673 2、lO．7O、42．88 g·m1 的血漿樣品各5份，依2．3 項(xiàng)下條件操作，于l d內(nèi)測定，計(jì)算日內(nèi)RSD 為0．9 ～ 1．2 ；問隔1～ 2 d，于2周內(nèi)考察，所得的日間RSD 為 3．0 ～ 4．1 。

 2．5．4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取芹菜素血漿濃度為0．673 2，42．88 g·ml 的低、高濃度樣品各3份，按2．4項(xiàng)下處理操作。在冷凍保存24 h后，于室溫(25℃)解凍，連續(xù)測定3次，各濃 度下的回收率為97．44 ～ 103．5 ，表明凍融后樣品穩(wěn) 定。

 2．5．5 酶解與未酶解血樣比較 Beagle犬靜脈給藥后，按2．2 項(xiàng)條件采集血樣。將血樣分別按照經(jīng)酶解及未經(jīng)酶解過程，其余均按照2．3項(xiàng)下條件操作，各時(shí)間點(diǎn)血藥濃度見表l。

 由表1可見，各時(shí)問點(diǎn)的血樣經(jīng)酶解過程后所得芹菜素濃度均高于未經(jīng)酶解過程處理的血樣(P<="">

 3 討論

 流動相中加入醋酸銨溶液可抑制芹菜素的酚羥基電離， 改善分離效果，減少拖尾，并因?yàn)槠渌嵝�，使峰形尖銳。采用乙酸乙酯為提取溶劑，回收率理想，并且不影響芹菜素的穩(wěn) 定性。采用336 nrn ^ 為檢測波長，比較靈敏且干擾較少。

 芹菜素在體內(nèi)存在部分葡萄糖醛酸及硫酸酯結(jié)合物。 表1的結(jié)果顯示，未酶解的血漿樣品的芹菜素含量明顯低于 酶解的血漿樣品，因此不經(jīng)水解或酶解直接測定其中的芹菜素不能準(zhǔn)確反映總濃度，從而不能合理反映芹菜素在體內(nèi)的 吸收、利用情況。曾考慮使用鹽酸水解，經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)色譜 圖中有較多雜質(zhì)峰干擾實(shí)驗(yàn)。后參考文獻(xiàn) 使用 葡萄糖苷酸酶及硫酸酯酶，更具有針對性，且對芹菜素圖譜無干擾。此外通過正交實(shí)驗(yàn)最終確定酶的濃度為 葡萄糖苷酸酶 (300 U ·ml )和硫酸酯酶(15 U ·ml )，在此條件下可酶 解完全。

 綜上所述，本方法用于測定Beagle犬血漿中芹菜素，不 僅方法準(zhǔn)確、方便，而且干擾少、靈敏度高，可滿足藥代動力學(xué)及臨床研究的要求。