大鼠腸道菌群對(duì)芹菜素代謝影響 | 大鼠腸道菌群對(duì)芹菜素代謝影響 |
| 發(fā)布時(shí)間:2014-03-24 信息來(lái)源:admin 發(fā)布人:admin 點(diǎn)擊次數(shù):1564 |
摘 要:目的研究大鼠腸道菌群對(duì)芹菜素的代謝影響。方法采用SD大鼠的新鮮糞便,用人工腸液溶解后加入芹菜素標(biāo)準(zhǔn)溶液,37℃厭氧孵化后采用（RP-HPLC）方法對(duì)芹菜素的代謝情況進(jìn)行定量分析。結(jié)果孵化后1h芹菜素迅速被腸道菌群代謝,隨著孵化時(shí)間的延長(zhǎng),芹菜素被大鼠腸道菌群代謝降解的速度放緩。結(jié)論在離體條件下,芹菜素容易被大鼠腸道菌群代謝。 關(guān)鍵詞:芹菜素 腸道菌群 降解 高效液相色譜 Metabolism of apigenin by rat intestinal flora Abstract:Objective To study the metabolism of apigenin in vitro intestinal flora from rat.Methods Apigenin was added to the rat fecal flora which was solved in the artificial intestinal juice.The mixture were anaerobically incubated at 37℃,then the metabolism of apigenin was analyzed and quantified by RP-HPLC.Results Apigenin was fast metabolized by rat intestinal flora after incubated 1 h.With the persistence of the incubation time,the speed slowed.Conclusion In vitro,apigenin is easily metabolized by rat intestinal flora. Key words:apigenin;intestinal flora;degradation;HPLC 芹菜素(apigenin)屬于黃酮類化合物，廣泛存在于水果、 蔬菜、豆類、茶葉中，其中芹菜含量最高。研究發(fā)現(xiàn)芹菜素具 有廣泛的藥理學(xué)作用和生物學(xué)特性，如抑制腫瘤、預(yù)防高血壓、抗氧化、抗菌、降低腫瘤細(xì)胞多耐藥性、抗突變等[1】。有觀 點(diǎn)認(rèn)為，芹菜素的健康促進(jìn)作用主要依賴于個(gè)體攝入量和生 物利用度。為了更好地了解芹菜素在體內(nèi)的吸收、分布、代謝等情況。本研究通過(guò)模擬大鼠腸道內(nèi)環(huán)境研究大鼠腸道菌群對(duì) 芹菜素代謝的影響。為其營(yíng)養(yǎng)學(xué)、藥理學(xué)及開發(fā)研究提供依據(jù)。 1 材料與方法 1．1 儀器與試劑 (1)儀器：Waters2690高效液相色譜檢測(cè) 儀(HPLC)；超純水器(德國(guó)SG公司)；高速冷凍離心機(jī)(美國(guó) Beckman公司)；超聲波清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司) GAST真空泵；水浴振蕩器(哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限 公司)。(2)試劑：芹菜素標(biāo)準(zhǔn)品(美國(guó)Sigma公司)；甲醇色譜純(山東禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司)；磷酸優(yōu)級(jí)純(天津科 密歐化學(xué)試劑有限公司)；水為重蒸水。 1．2 芹菜素標(biāo)準(zhǔn)貯備液 準(zhǔn)確稱取芹菜素標(biāo)準(zhǔn)品50．0 mg，置于50 rrIl容量瓶中。用流動(dòng)相溶解并稀釋定容至刻度，此溶液為1 mg／ml的芹菜素標(biāo)準(zhǔn)貯備液，放入4"C冰箱中備用。 1．3 樣品預(yù)處理 1．3_．1 人工腸液的配制 稱取6．8gKH2P04溶解250 ml水中，加入190ml 0．2mol／L的NaOH和400 ml水，混勻，用0．2 moVL的NaOH調(diào)節(jié)混合液的pH值至7．5±0．1，加水定容 至1 000 nd。 1．3．2 鼠糞收集 成年SD清潔級(jí)大鼠20只，體重180～ 230g，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供；收 集新鮮鼠糞。準(zhǔn)確稱量60g。 1．3．3 鼠糞樣品的處理 將60 g新鮮鼠糞溶解于180 m1人 工腸液中，用磁力攪拌器攪拌均勻后，用雙層紗布過(guò)濾，取 18．5 rrIl濾液加入0．27 ml 1 mg／ml芹菜素標(biāo)準(zhǔn)溶液混勻作為 樣品；另取18．5 rrI1人工腸液加入0．27 ml 1 me,／ml芹菜素標(biāo) 準(zhǔn)溶液混勻作為樣品對(duì)照；分別取樣品和樣品對(duì)照0．6 m1分 裝至2 ml離心管中(樣品和樣品對(duì)照各裝30個(gè)離心管)，充入c02，封口膜封口。 1．3．4 樣品制備與分析 將分裝后的離心管于水浴振蕩器中以37’12，80 r／min孵化，孵化前留取0 h樣品及0 h人工腸液樣 品對(duì)照。然后分別留取孵化后1，4，8，24 h的樣品和樣品對(duì)照 (每個(gè)時(shí)間點(diǎn)樣品和樣品對(duì)照均平行6份)。將樣品和樣品對(duì)照取出后放入一40"C冰箱中保存。分析前先將樣品解凍，高速冷凍離心機(jī)4"C，9800 g離心15 min，取上清液，用氮?dú)獯蹈珊?加0．6 ml流動(dòng)相溶解，取10 進(jìn)樣進(jìn)行HPLC測(cè)定。 1．4 色譜條件 色譜柱為Phenomenex C1R柱(250×4．60 mm，4 m)；流動(dòng)相：甲醇／0．1％磷酸(60／40，v／v)；超聲波脫 氣；流速：1．0 ml／mim；柱溫為30"C；檢測(cè)波長(zhǎng)為339 nm；進(jìn)樣 量為10 ；采用等度洗脫。 2 結(jié)果 2．1 色譜圖(圖1，圖2) 圖1顯示，芹菜素保留時(shí)間為 14．040 min。圖2顯示，芹菜素與大鼠孵育液中的其他成分分離完全。
囝1 芹菜素標(biāo)準(zhǔn)品色譜囝
圖2 樣品色譜囝 2．2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測(cè)限 以芹菜素標(biāo)準(zhǔn)貯備液配制0．5，1， 2，4，8，10 ug／ml的標(biāo)準(zhǔn)系列，按色譜條件分別進(jìn)樣，對(duì)每一濃 度均求其5次測(cè)量的平均值，以峰面積積分值(y)對(duì)濃度 (x)進(jìn)行線性回歸，得出直線回歸方程Y=37975X一2645， 9。r=0．9995( =5)。線性范圍為0．5～10 g／rnl。以3倍 噪音濃度為最低檢出限，得芹菜素的最低檢出限濃度為0．11 Ve,／ml。 2．3 精密度實(shí)驗(yàn) 取4 g／rnl的芹菜素標(biāo)準(zhǔn)溶液10 ，按色譜條件進(jìn)樣，連續(xù)進(jìn)樣10次。測(cè)得芹菜素峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn) 偏差(RSD)為0．55％，表明儀器進(jìn)樣精密度良好。 2．4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取預(yù)先滅菌的腸道菌孵育液18．5 ml，加 入0．27 mll m／m1芹菜素標(biāo)準(zhǔn)溶液，樣品預(yù)處理后按色譜條 件進(jìn)樣，分別測(cè)定孵化0，1，4，8，24 h后其中芹菜素的含量。 測(cè)得芹菜素峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2．86％，表明芹菜素在滅菌的大鼠腸道菌孵育液中24 h內(nèi)穩(wěn)定。 2．5 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 取大鼠腸道菌孵育液18．5 ml，加入0．27 mll mg／ml芹菜素標(biāo)準(zhǔn)溶液，樣品預(yù)處理后按色譜條件進(jìn)樣， 測(cè)定孵化后4 h的樣品中芹菜素的含量(設(shè)6個(gè)平行樣)。測(cè)得芹菜素峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0．78％，表明該方 法的重現(xiàn)性較好。 2．6 回收率實(shí)驗(yàn) 取預(yù)先滅菌過(guò)的大鼠糞便菌孵育液0．5 ml，準(zhǔn)確加入1，5，10 g／m1濃度的芹菜素標(biāo)準(zhǔn)品溶液80 l， 每個(gè)濃度平行5份。樣品預(yù)處理后按色譜條件進(jìn)樣。芹菜素 的回收率在98．1％～99．0％之間。 2．7 芹菜素體外腸道菌代謝 芹菜素在離體培養(yǎng)的大鼠腸道菌孵育液中降解較多，在人工腸液中降解較少，而在滅菌后 的大鼠腸道菌育液中幾乎無(wú)降解，說(shuō)明腸道菌群影響芹菜素 的代謝。 3 討論 腸道菌群對(duì)物質(zhì)的代謝或化學(xué)修飾作用國(guó)內(nèi)外研究最多的是藥物，研究多采用高效液相色譜法[ ．3]，其中整體實(shí)驗(yàn)研 究較多，離體實(shí)驗(yàn)研究相對(duì)較少。有關(guān)腸道菌群對(duì)黃酮類物質(zhì)的代謝目前主要集中在不同膳食類型黃酮類物質(zhì)吸收代謝 情況的差異[4]、同種類型不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的黃酮類物質(zhì)代謝情況的差異Is3、加入催化反應(yīng)的酶后黃酮類物質(zhì)代謝情況的變 化C63、不同黃酮類物質(zhì)代謝后代謝產(chǎn)物的研究[73等。本研究 發(fā)現(xiàn)，在離體條件下，芹菜素易被大鼠腸道菌群降解，孵化1 h 后芹菜素迅速被腸道菌群代謝，隨著孵化時(shí)間的延長(zhǎng)，芹菜素 被大鼠腸道菌群代謝的速度放緩，至24 h后孵育液中芹菜素 含量最低。另外，在不同環(huán)境下，芹菜索降解有較大差異，在 滅菌后的大鼠腸道菌孵育液中幾乎無(wú)降解，在人工腸液中有 少量降解，在大鼠腸道菌孵育液中降解較多。通過(guò)人工腸液和滅菌后的大鼠腸道菌孵育液作為對(duì)照．表明在大鼠腸道菌 孵育液中芹菜素的降解主要是腸道菌群的作用。通過(guò)0 h樣 品與1，4，8，24 h樣品的比較，表明未經(jīng)孵化的腸道菌群對(duì)芹菜素?zé)o降解作用，而經(jīng)過(guò)水浴振蕩器37"(2，80 r／min孵化的腸道菌群可以對(duì)芹菜素進(jìn)行代謝降解。 |
