芹菜素（洋甘菊提取物）延緩人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞衰老的體外實(shí)驗(yàn)研究 | 芹菜素（洋甘菊提取物）延緩人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞衰老的體外實(shí)驗(yàn)研究 |
| 發(fā)布時(shí)間:2014-04-29 信息來源:admin 發(fā)布人:admin 點(diǎn)擊次數(shù):1421 |
| 研究表明，衰老的內(nèi)皮細(xì)胞中一氧化氮(NO) 生成減少，活性氧簇(ROS)生成增多，從而引發(fā)內(nèi)皮功能性障礙及各種心血管疾病。提示，可通過延緩 內(nèi)皮細(xì)胞的衰老進(jìn)程來預(yù)防心血管疾病的發(fā)生。而 人內(nèi)皮細(xì)胞的衰老過程受多種因素的影響和 調(diào)節(jié)[1-4 3。 洋甘菊提取物芹菜素(apigenin)是天然存在的一種天然黃酮 類化合物，廣泛存在于多種水果、蔬菜、豆類和茶葉中，具有抗腫瘤、抗炎、降血壓、抗動(dòng)脈硬化和血栓、 抗焦慮、抗菌抗病毒以及抗氧化等多種藥理活 性 J，但對(duì)細(xì)胞衰老過程的直接影響尚未見有報(bào)道。本文旨在研究芹菜素對(duì)體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞衰老的延緩作用及其相關(guān)機(jī)制。 1 儀器與材料 3llO型CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Forma公司)； FACS Calibur型流式細(xì)胞儀(美國(guó)Becton Dickinson 公司)。M199培養(yǎng)基(Invitrogen公司)；雙氫羅丹明 (dihydrorhodamin 123，DHR，Sigma公司)；／3一半乳糖 苷酶檢測(cè)試劑盒(欣百諾公司)；NO檢測(cè)試劑盒 (Cayman chemicals公司)；芹菜素(色譜純，由上海 醫(yī)藥工業(yè)研究院王震宇博士惠贈(zèng))；其他試劑均為 國(guó)產(chǎn)分析純。 2 方法 2．1 細(xì)胞培養(yǎng) 參照文獻(xiàn)[1]方法，鑒定并培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮 細(xì)胞，直至第12代(老年細(xì)胞)。其間，自第4代細(xì)胞(幼年細(xì)胞)起，與芹菜素(1、3、10 p~mol·L )共 孵育，每48小時(shí)更換1次共孵液。 2．2 細(xì)胞衰老程度的測(cè)定 一半乳糖苷酶(SA盧一ga1)的活性可表征細(xì)胞衰老的程度，通常該酶在衰老細(xì)胞中高表達(dá)。采用文獻(xiàn)[6]方法，將內(nèi)皮細(xì)胞固定，檢測(cè)其SA 一gal陽(yáng)性 率，以此推斷細(xì)胞的衰老程度。 2．3 細(xì)胞中活性氧簇水平的測(cè)定 DHR是一種極易被氧化的親脂性染料，可自由 穿過細(xì)胞膜，進(jìn)人細(xì)胞后可被ROS(主要為超氧化 物、過氧化氫和過氧化亞硝基)氧化成帶有正電荷、 能發(fā)出熒光的Rh123，并被泵人線粒體內(nèi)，從而滯留 和累積在細(xì)胞內(nèi)。采用流式細(xì)胞儀(激發(fā)波長(zhǎng)： 488 nm；發(fā)射波長(zhǎng)：525 nm)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Rh123的熒光強(qiáng)度，以此判斷細(xì)胞內(nèi)ROS水平。通過流式細(xì) 胞儀所配置的軟件對(duì)所測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，每個(gè)樣品 測(cè)定10 000個(gè)活細(xì)胞，采用直方圖分析獲得的平均 熒光強(qiáng)度(MFI)，該值即代表細(xì)胞ROS水平。 2．4 細(xì)胞中一氧化氮水平的測(cè)定 硝酸鹽／亞硝酸鹽是細(xì)胞中NO的穩(wěn)定代謝物， 其在細(xì)胞培養(yǎng)液中的含量可表征細(xì)胞中NO水平。 吸取細(xì)胞培養(yǎng)液上清，3 000 r·min 離心10分鐘， 于一20℃存放，然后用NO檢測(cè)試劑盒檢測(cè)其硝酸鹽／亞硝酸鹽含量，以此推斷細(xì)胞中NO水平。 2．5 統(tǒng)計(jì)方法 所有數(shù)據(jù)均用元±s表示。用t檢驗(yàn)或ANOVA 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間檢驗(yàn)采用post hoc Tukey S 3 結(jié)果 3．1 洋甘菊提取物芹菜素致細(xì)胞一半乳糖苷酶陽(yáng)性率降低作用 考察 與幼年細(xì)胞組相比，老年細(xì)胞對(duì)照組內(nèi)皮細(xì)胞 SA 一gal陽(yáng)性率提高了約10倍。在老年細(xì)胞組中， 與未加芹菜素的對(duì)照組相比，芹菜素組(1、3、 10 Ixmol·L )內(nèi)皮細(xì)胞中SA 一gal陽(yáng)性率呈洋甘菊提取物芹菜素劑量依賴性降低，其中10 I~mol·L 劑量組降低最 明顯，達(dá)27％ ，提示芹菜素可延緩內(nèi)皮細(xì)胞的衰老 (見圖1)。 3．2 洋甘菊提取物芹菜素致細(xì)胞中活性氧簇水平降低及一氧化氮水平升高作用考察 與幼年細(xì)胞組相比，老年細(xì)胞對(duì)照組細(xì)胞中ROS 水平上升了約3倍。在老年細(xì)胞組中，與未加芹菜素 的對(duì)照組相比，芹菜素組(1、3、10~xrnol·L )內(nèi)皮細(xì) 胞中ROS水平呈芹菜素劑量依賴性下降，其中 10 I~mol·L 劑量組下降最明顯，達(dá)46％(見圖2)。 與幼年細(xì)胞組相比，老年細(xì)胞對(duì)照組培養(yǎng)液上 清中硝酸鹽／亞硝酸鹽含量下降了約50％ 。在老年 細(xì)胞組中，與未加芹菜素的對(duì)照組相比，芹菜索組 (1、3、10 Ixmol·L )培養(yǎng)液上清中硝酸鹽／亞硝酸鹽含量呈芹菜素劑量依賴性增加，其中10 p~mol·L 劑量組增加最明顯，達(dá)1．73倍(見圖3)。 4 討論 內(nèi)皮細(xì)胞衰老是誘發(fā)各種心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)因 素之一，隨著生理年齡的增長(zhǎng)，內(nèi)皮可發(fā)生功能性障 礙而誘發(fā)各種心血管損害 墻J。已有大量研究表 明，內(nèi)皮細(xì)胞在衰老過程中，其胞內(nèi)NADPH氧化 酶、線粒體及內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)的功能易 發(fā)生異常，從而使得ROS水平上升；且許多疾病均 與自由基的大量產(chǎn)生即氧化應(yīng)激有關(guān)，如癌癥、心血管疾病、缺血／再灌損傷、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病、神 經(jīng)退行性疾病(阿爾茨海默病、帕金森病)等。本試 驗(yàn)首次證明，芹菜素可以延緩體外培養(yǎng)的人臍靜脈 內(nèi)皮細(xì)胞衰老，并且該作用與內(nèi)皮細(xì)胞中ROS的生 成減少以及NO的生成增加有關(guān)。早在20世紀(jì)50 年代，Harman(J Gerontol，1956年)就提出“氧化應(yīng) 激決定壽命”，即自由基衰老學(xué)說，氧化應(yīng)激被認(rèn)為 是衰老的主要原因之一。NO對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的衰老也 具有重要的調(diào)節(jié)作用，NO供體可以延緩內(nèi)皮細(xì) 胞的衰老 J。而芹菜素則可能至少部分是通過降低胞內(nèi)ROS的水平和增加NO的合成而延緩內(nèi)皮 細(xì)胞衰老。 洋甘菊提取物芹菜素能夠延緩內(nèi)皮的衰老，提示其可能具阻 止或逆轉(zhuǎn)老年性內(nèi)皮衰老的作用，從而有利于心血管疾病的預(yù)防和治療。當(dāng)然，本試驗(yàn)只是在離體條 件下的體外研究，至于芹菜素在體內(nèi)的抗衰老作用 及其確切的分子機(jī)制，仍有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。 |
