芹菜素又名芹黃素，屬于黃酮類化合物，芹菜 素的化學(xué)結(jié)構(gòu)為5，7，4 三羥基黃酮，廣泛存在 于蔬菜、水果中．其5，7，4 位置的三個(gè)羥基和C2， C3雙鍵決定了其獨(dú)特的藥理學(xué)效應(yīng)和生物學(xué)特 性．研究表明，芹菜素有降壓和影響中樞神經(jīng)、抑 制致癌物質(zhì)的致癌活性和保護(hù)心臟的作用，可用 于治療帕金森氏癥，也可以作為抗HIV抗病毒藥 物及MAP激酶的抑制劑，及消炎作用等 4。
目前測(cè)定芹菜素的方法主要有毛細(xì)管電泳 法 、反相高效液相色譜法 j、毛細(xì)管電泳～ 電 化學(xué)檢測(cè)法 和鋁顯色分光光度法¨ 等，熒光光 度法尚未見報(bào)道．本研究旨在利用芹菜素對(duì)丹酰氯的熒光猝滅作用，建立熒光猝滅法測(cè)定芹菜中 芹菜素的新方法．一般而言，熒光猝滅法比直接熒 光測(cè)定法更為靈敏，具有更高的選擇性
1 實(shí)驗(yàn)部分
1．1 主要儀器和試劑
RF5310型熒光光度計(jì)(日本島津公司)；F一 4500型熒光光度計(jì)(日本日立公司)． 芹菜素(金測(cè)分析技術(shù)有限公司)標(biāo)準(zhǔn)溶液： 3．700×10～mol／L，溶劑為6o％ 乙醇溶液；丹酰氯 (DNS—C1，Alfa Aesar 10141137)溶液：0．05 g／L，溶劑 為60％ 乙醇溶液． 所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水．
1．2實(shí)驗(yàn)方法
于10 mL具塞比色管中，依次加入0．05 g／L 丹酰氯溶液0．25 mL、pH 7．00 Tris—HC1緩沖溶 液2．0 mL和一定體積的芹菜素標(biāo)準(zhǔn)溶液，60％ 乙醇定容至5．00 mL，20 oC放置10 min；220—650 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)熒光光譜掃描，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬 度始終為10 Nm．并在A =320 nln，A =480 am 處，測(cè)定溶液的熒光強(qiáng)度 和 (試劑空白)，以 △F(AF=Fo一，)對(duì)芹菜素物質(zhì)的量濃度進(jìn)行線 性回歸．
2 結(jié)果與討論
2．1 光譜特征
2．1．1 三維熒光光譜
圖1～圖3分別為芹菜素、DNS—C1、芹菜素 與DNS—C1結(jié)合后的三維熒光光譜圖．由圖1可 見，芹菜素在乙醇溶液中并不具有熒光現(xiàn)象，而 DNS—cl溶液( 圖2)在A =320 nm，A。 = 480 nm處有很強(qiáng)的熒光．從圖3可知，隨著芹菜素 的加入，DNS—C1在A ：480 am處的熒光峰明顯下降，這可能是DNS—C1與芹菜素發(fā)生了結(jié) 合，形成酚酯產(chǎn)物 ．
2．1．2 熒光光譜
DNS—C1的熒光強(qiáng)度隨芹菜素含量的增加而 逐漸減弱，在A ：480 nm處的熒光強(qiáng)度減弱程 度與芹菜素含量有良好的線性關(guān)系，如圖4(曲線 1～6)，因此選擇A =480 am作為測(cè)量波長(zhǎng)．
2．2 結(jié)合比推導(dǎo)
DNS—CI與芹菜提取物芹菜素的結(jié)合受很多因素影響， 而結(jié)合常數(shù)可反應(yīng)主客體的結(jié)合力度．Benesi— Hildebrand[1 法是利用光譜法來測(cè)定主客體結(jié) 合物形成常數(shù)的最經(jīng)典的方法． 如果DNS—C1與芹菜素形成1：1結(jié)合物，則 可表示為： JK． DNS—C1+Cl5H1o05 DNS —C1·C】5H1o05 熒光強(qiáng)度變化值F同芹菜素濃度的關(guān)系為： 1 l F Fo—F 1 l 麗 麗+ 百 麗 (1) 如果DNS—C1與芹菜素形成1：2結(jié)合物，則 可以表示為： ． DNS—C1+C15H1005 DNS—C1·2C15Hlo0s 熒光強(qiáng)度變化值F同芹菜素濃度的關(guān)系為： 1 l AF Fo—F 一— — — — — — — — — — — — — — — — — — — 一 — — — — — — 一 Kl [DNS—C1][cl5HloO5] [C15H1oO5] (2) 式中，F(xiàn)， 分別為芹菜素濃度為一定值和為零時(shí) 溶液的熒光強(qiáng)度， 為常數(shù)，K．為結(jié)合常數(shù)，[DNS — c1]為DNS—C1的濃度，[C15H。。05]為c H o05 的濃度．
由式(1)可知，若1／ △F對(duì)l／[C H。。0 ]作 圖得一直線，則結(jié)合比為1：1．由式(2)可知，若1 ／△F對(duì)1／[c H 。05] 作圖得一直線，則結(jié)合比為1：2．如圖5所示，我們可以看到1／ △F與1／ [c， H 。0 ]有很好的相關(guān)性(R=0．996 3)．因此， 我們認(rèn)為DNS—C1與芹菜素的結(jié)合比為1：1．
2．3 試劑用量選擇
2．3．1 緩沖液類型及其酸堿度和用量的選擇 分別試驗(yàn)了pH值為4．0、4．8、5．6的HAc— NaAc緩沖液和pH值為7．00、7．50、8．00、8．40、 9．00的Tris—HC1緩沖液對(duì)體系熒光猝滅程度的 影響．發(fā)現(xiàn)體系在pH 7．00～8．【)(】的Tris—HC1緩 沖液中F值最大．故實(shí)驗(yàn)選擇pH=7．50的Tris— HC1溶液作為體系的緩沖試劑．通過Tris—HC1緩 沖液的用量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，其適宜用量范圍為1．5～ 2．5 mL，超出該范圍時(shí)F值出現(xiàn)降低．這可能是 用量不足時(shí)，Tris—HC1緩沖效果不好；當(dāng)Tfis— HC1緩沖液加入量過高時(shí)，反而抑制了芹菜提取物芹菜素與丹酰氯的作用，使F值降低．實(shí)驗(yàn)選擇pH 7．50的 Tris—HC1緩沖液用量為2．00 mL．
2．3．2 DNS—C1乙醇溶液用量的選擇
DNS—C1乙醇溶液的適宜用量范圍為0．10— 0．30 mL，超出該范圍時(shí)F值明顯降低．這可能是 DNS—C1用量不足時(shí)，酚酯產(chǎn)物太少，熒光猝滅程 度低；而當(dāng)DNS—CI用量過高時(shí)，抑制了酚酯的 自聚作用，使熒光猝滅程度降低．實(shí)驗(yàn)表明加入 DNS—C1用量在0．25 mL時(shí)，F(xiàn)出現(xiàn)最大值，故選 擇加入0．05 g／L的DNS—CI乙醇溶液0．25 mL．
2．3．3 反應(yīng)時(shí)間與溫度的選擇
實(shí)驗(yàn)表明，體系在試劑完全混合后迅速反應(yīng)， 室溫放置10 min后體系的熒光值達(dá)到最大，且2 h 內(nèi)體系熒光值基本保持不變．本文選擇體系反應(yīng) 10 min后測(cè)定．
考察了反應(yīng)溫度在15～35℃ 時(shí)對(duì)體系熒光 猝滅程度的影響．溫度高于25℃ 時(shí)，猝滅強(qiáng)度變 化值F隨著溫度的升高而減小，可能原因是升溫時(shí)分子熱運(yùn)動(dòng)增加，分子間作用力和疏水作用減 弱，導(dǎo)致分子復(fù)合物穩(wěn)定性降低；當(dāng)溫度低于 15℃時(shí)，空白熒光值較小，F(xiàn)變化不大，可能是低 溫條件下，反應(yīng)太慢．故實(shí)驗(yàn)選擇室溫(約20c{：) 下反應(yīng)10 rain后測(cè)定．
2．3．4 試劑加入順序的影響
在已優(yōu)化的試驗(yàn)條件下，分別1)芹菜提取物芹菜素一一+ Tris—HGl緩沖液_．+DNS—cl；2)DNS—c Tds— HCI緩沖液一芹菜素；3)芹菜素一DNS—C1 Tris — HCI緩沖液；三種順序加人試劑．結(jié)果表明，按 順序2)加入試劑出現(xiàn)的 值最大，故確定2)為 本實(shí)驗(yàn)試劑加入順序．
2．4 干擾試驗(yàn)
考察了蔬菜中可能存在的干擾物質(zhì)對(duì)測(cè)定結(jié) 果的影響．當(dāng)相對(duì)誤差控制在±5％ 以內(nèi)時(shí)： 1 000倍量的Na 、c 、Ban、C1一、NO；、NO；、草 酸；100倍量的SO 、K 、甲醇、丙酮，均不干擾 測(cè)定．同為黃酮類物質(zhì)的槲皮素、蘆丁對(duì)本實(shí)驗(yàn)是 有干擾的，但一般芹菜中的槲皮素、蘆丁相對(duì)芹菜提取物芹菜 素來說，含量少，對(duì)測(cè)定的干擾可以忽略不計(jì)．
2．5 方法線性范圍、檢出限和精密度
在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，向體系中加入不同量 的芹菜素標(biāo)準(zhǔn)溶液按1．2實(shí)驗(yàn)方法操作，DNS— Cl熒光猝滅程度(AF)與芹菜素在6．40 X 10一 mol／L一5．92 X 10 mol／L濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn) 良好的線性關(guān)系，回歸方程為△，= 112．18 C 。 (×10 mol／L)一1．25，相關(guān)系數(shù)為0．9989．按實(shí) 驗(yàn)方法進(jìn)行11次空白值測(cè)定，按C =3Sb／k(Sb 表示標(biāo)準(zhǔn)偏差，k表示校準(zhǔn)曲線的斜率)計(jì)算檢出 限為1．92 X 10～mol／L．
測(cè)定溶液中芹菜素含量分別為3．0 X 10 tool／L(低濃度)、3．0 x 10 mol／L(中濃度) 和5．0 X 10 mol／L(高濃度)，各作9份平行實(shí) 驗(yàn)，計(jì)算得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為4．2％ 、3．9％ 和 2．4 ％ ．
3 樣品分析
將市售芹菜除去非食用部分，稱取4．O0 g樣 本參照文獻(xiàn)[17]處理，制得樣品分析溶液．取樣 品分析溶液1．O0 mL按1．2實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定， 結(jié)果如表1．
4 小結(jié)
由實(shí)驗(yàn)可知，在pH 7．50 Tifs—HC1緩沖液 中，芹菜提取物芹菜素與DNS—C1作用，在A ：480 nm處產(chǎn) 生熒光猝滅，DNS—C1熒光猝滅程度與加入芹菜 素的量在一定范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，據(jù)此建 立熒光猝滅法測(cè)定蔬菜中芹菜素含量的新方法． 該方法簡(jiǎn)單快速用于實(shí)際樣品的分析，結(jié)果滿意． | 
丹酰氯熒光猝滅法測(cè)定芹菜中芹菜素（芹黃素）含量 
