【摘要】目的建立用高效液相色譜法測定復(fù)方虎杖片大黃素含量的方法。方法用phenomenexprodigyODS3(250mm×4．6mm，5μm)色譜柱，流動相：甲醇-0．1%磷酸溶液(85∶15)，流速：1．0ml/min，檢測波長：254nm，進(jìn)樣量為5μl。結(jié)果對照品線性范圍為12．02～72．14μg/ml，平均回收率為100．69%，RSD=1．42%(n=6)。結(jié)論該方法簡便可行，重復(fù)性好，能有效控制復(fù)方虎杖片的質(zhì)量。
【關(guān)鍵詞】復(fù)方虎杖片；大黃素；高效液相色譜法 長沙上禾生物
復(fù)方虎杖片原標(biāo)準(zhǔn)收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第三冊，只有鑒別、檢查項目，專屬性差；沒有建立含量測定方法，屬國家藥品標(biāo)準(zhǔn)提高行動計劃品種。該品種由虎杖提取物、功勞木提取物、枇杷葉提取物組成，具有清熱、祛痰、止咳、平喘，用于慢性支氣管炎。因虎杖提取物在成藥之中所占比重較大，主要活性成分有大黃素、大黃素甲醚、大黃酚、芪三酚、芪三酚苷等。由于產(chǎn)地不同，采挖季節(jié)不同，主要成分的含量也有很大的差別，同時芪三酚、芪三酚苷未有符合含量測定要求的對照品，因此，為控制其質(zhì)量，本實(shí)驗采用高效液相色譜法測定其大黃素的含量，以其作為指標(biāo)性成分，從而達(dá)到控制產(chǎn)品質(zhì)量的目的。
大黃素生產(chǎn)企業(yè)：長沙上禾生物科技有限公司 www.csnutilities.com
1儀器、試劑與樣品
儀器：TU-1901紫外可見分光光度計，sartoriusCP225D電子分析天平，島津LC-2010A全自動高效液相色譜儀，Lcsolution工作站，KQ-400KDB數(shù)控超聲波清洗器。
對照品：大黃素對照品(批號：110756-200110中國藥品生物制品檢定所，供含量測定用，純度為100．00%，符合定量測定要求)。
試劑與樣品：甲醇為色譜純，水為高純水，其他制劑均為分析純。復(fù)方虎杖片及缺虎杖的陰性對照樣品(廣西河豐藥業(yè)有限公司提供)。
2方法與結(jié)果
2．1色譜條件色譜柱phenomenexprodigyODS3(250mm×4．6mm，5μm)，流動相：甲醇-0．1%磷酸溶液(85∶15)[1,2]，流速：1．0ml/min，檢測波長：254nm，柱溫：30℃。理論塔板數(shù)(n)按大黃素峰計算，應(yīng)不低于9000，進(jìn)樣量為5μl。
2．2對照品溶液的制備精密稱取五氧化二磷減壓干燥24h大黃素對照品適量，加甲醇制成每1ml含0．5mg的備用溶液，作為對照品貯備液。另精密量取貯備液適量，加甲醇制成每1ml含30μg的溶液，作為對照品溶液，即得。
2．3供試品溶液的制備取本品，除去包衣，研細(xì)，混勻，取0．1g，精密稱定，加0．5mol/L硫酸溶液20ml，加氯仿30ml，80℃水浴回流2．5h，分取氯仿層，酸液用氯仿提取3次，每次10ml，合并氯仿提取液，蒸干，殘渣加甲醇適量使溶解，置25ml容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。精密量取2ml，置10ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。
2．4陰性樣品溶液的制備取陰性樣品，按2．3項方法制備陰性樣品溶液。
在上述色譜條件下,分別進(jìn)樣對照品、供試品、陰性樣品各5μl，大黃素保留時間約為9min，陰性樣品對測定無干擾。見圖1~3。
2．5線性關(guān)系考察精密稱取大黃素對照品10．02mg，置100ml量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1．2、2．4、3．6、4．8、6．0、7．2ml，分別置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，精密吸取上述溶液各5μl，分別注入液相色譜儀，測定，記錄峰面積，以峰面積(Y)對濃度(X)作圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程：Y=1．8248×104X-1．8952×102，r=0．9999，結(jié)果表明：大黃素在12．02～72．14μg/ml線性范圍內(nèi)，濃度與大黃素峰面積呈良好的線性關(guān)系。見圖4。
2．6精密度試驗取同一供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，結(jié)果RSD為0．14%。
2．7重復(fù)性試驗取同一批樣品6份，按上述方法測定大黃素的含量，結(jié)果RSD為1．26%。
2．8穩(wěn)定性考察取“2．7”項下供試品溶液，在0，4，8，12，16，20，24h分別進(jìn)樣5μl，記錄峰面積，結(jié)果峰面積的RSD為0．19%，表明供試品溶液在24h內(nèi)均穩(wěn)定。
2．9加樣回收率試驗精密稱取同一批次(061201批)樣品，(大黃素含量為8．6578mg/片，平均每片重為0．2624g)約0．05g。共取6份樣，分別精密加入大黃素對照品儲備液1．5ml，按上述方法測定，計算加樣回收率。結(jié)果平均回收率為100．69%，RSD=1．42%(n=6)，符合定量分析的要求，詳見表1。
3樣品測定
按上述含量測定方法，測定10批樣品中大黃素的含量，結(jié)果見表2。
4討論
4．1本品主要成份游離蒽醌衍生物，不溶于水，溶于乙醇、乙醚、氯仿、苯等。當(dāng)用氯仿等有機(jī)溶劑從水溶液中萃取游離蒽醌衍生物時必須加酸酸化使之處于游離狀態(tài)。從參考資料上得知，大多都以苯-硫酸或氯仿-硫酸為溶媒提取。本實(shí)驗將氯仿、苯的提取結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果氯仿對大黃素的選擇性較好，在HPLC色譜圖上雜質(zhì)峰較少，易于分離。而且苯毒性太大。因此，采用以氯仿-硫酸為溶媒進(jìn)行提取。
4．2用浸泡、超聲、加熱回流三種方法對大黃素的提取進(jìn)行了考察，實(shí)驗表明，在相同的條件下，浸泡方法所測得含量最低；采用超聲方法提取時，溶液乳化現(xiàn)象較嚴(yán)重，有渾濁現(xiàn)象，而且所測得含量較低；采用加熱回流提取方法，效果最好。
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HPLC測定復(fù)方虎杖片中大黃素的含量 
