摘 要:通過對近幾年來金銀花中主要有效成分綠原酸的含量測定方法和藥材的指紋圖譜進(jìn)行綜述,為今后的深入研究提供參考。
關(guān)鍵詞:金銀花綠原酸 含量測定 提取方法 指紋圖譜 金銀花提取物綠原酸
金銀花為忍冬科植物忍冬紅腺忍冬山銀花或毛花柱忍冬的干燥花蕾或帶初開的花。該藥為中醫(yī)常用藥，綠原酸為金銀花的主要功能性成分，其藥效高低取決于綠原酸的含量。綠原酸為咖啡�？崴嵫苌�，易溶于乙醇、丙酮，微溶于乙酸乙酯，是一種重要的生理活性物質(zhì)，它具有抗菌、抗病毒、解熱、升高白細(xì)胞、保肝利膽、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、降血壓、降血脂、清除自由基等作用。筆者在本文中綜述了金銀花藥材的指紋圖譜研究進(jìn)展及其主要有效成分綠原酸的含量測定方法，為今后的深入研究提供參考。
1綠原酸含量測定方法
除中國藥典規(guī)定的檢測方法外，已見報道的分析方法有紫外分光光度法、導(dǎo)數(shù)光譜法、薄層層析法、阻抑一催化褪色光度法、毛細(xì)管區(qū)帶電泳法、高效液相色譜法(HPLC 法)等。
1．1紫外分光光度法
李娜等“1研究建立了金銀花提取液中綠原酸含量的UV快速測定方法，經(jīng)HPLC檢驗(yàn)，該方法準(zhǔn)確、快速、方便，紫外光譜中和綠原酸含量相關(guān)性最佳的波長點(diǎn)為294 nm，綠原酸含量測定值和預(yù)測值之間具有良好的相關(guān)性(r=0．995 2，n=l1)，此方法可用于清開靈注射液生產(chǎn)過程中金銀花提取液的在線質(zhì)量控制；由于綠原酸分子中含有酚羥基，張秋芳等1根據(jù)酚類物質(zhì)中酚羥基與三氯化鐵的顯色反應(yīng)，發(fā)覺綠原酸與FeC 1，的顯色反應(yīng)產(chǎn)物的光密度與綠原酸的含量呈良好的線性關(guān)系，因此建立了綠原酸含量的UV快速測定方法，此方法所得綠原酸含量皆高于HPLC法，但其差異皆< 1O％，這可能是由于金銀花中還會有少量其他物質(zhì)也會與顯色劑發(fā)生了顯色反應(yīng)，這提示在實(shí)際應(yīng)用中，應(yīng)根據(jù)不同產(chǎn)地金銀花的成分及其含量高低等對此快速測定法的實(shí)測結(jié)果進(jìn)行必要校正。
1．2 差示導(dǎo)數(shù)光譜法
林黎明I31發(fā)現(xiàn)以鎢酸鈉為分析試劑，能快速與總綠原酸反應(yīng)生成復(fù)合物，根據(jù)其光譜的特征性變化，采用差示導(dǎo)數(shù)分光光度法可不經(jīng)分離直接測定金銀花及其制劑銀翹解毒片中的總綠原酸的含量．其平均回收率為100．4％，變異系數(shù)為1．82％。方法簡便，快速，準(zhǔn)確。
1．3導(dǎo)數(shù)極譜法
李白林研究了綠原酸在檸檬酸介質(zhì)中的電化學(xué)行為和綠原酸含量的線性掃描二階導(dǎo)數(shù)極譜法測定，發(fā)現(xiàn)在NH 一NH Cl介質(zhì)中，綠原酸不穩(wěn)定，易分解，導(dǎo)致較大的分析誤差。而在檸檬酸鈉介質(zhì)中，對金銀花浸取液和銀黃注射液進(jìn)行綠原酸含量的測定，獲得令人滿意的結(jié)果。
1．4薄層色譜掃描法
徐強(qiáng)等以薄層掃描法測定咽爽袋泡劑中金銀花中的綠原酸的含量，用薄層掃描儀進(jìn)行光譜掃描后，確定以三氯甲烷一醋酸乙酯一甲酸(2：2：1)為展開劑，雙波長反射法鋸齒掃描，= 325nm，=327nm，S 3，此方法簡便，測定準(zhǔn)確；魏云等l也采用了薄層掃描法對金銀花中綠原酸進(jìn)行了測定，樣品提取條件經(jīng)試驗(yàn)表明，甲醇、7O％乙醇使斑點(diǎn)容易擴(kuò)散，使用乙醇提取效果較好，薄層條件經(jīng)比較，選用氯仿一醋酸乙酯一甲酸(4：4：2)為展開劑能達(dá)到較好的分離效果，鋸齒形反射法雙波長掃描，325nm，R4OOnm，掃描速度20ram ／rain，狹縫1．25ram ×1．25ram，記錄儀靈敏度×2，線性參數(shù)×3；李宗等”1用聚酰胺薄膜分離綠原酸，用薄層掃描法測定其含量，為金銀花及其制劑海菊沖劑的質(zhì)量控制提供了一個新的方法。利用聚酰胺薄膜對綠原酸進(jìn)行分離和定量，色譜峰形好，消除了綠原酸在硅膠薄層上的拖尾現(xiàn)象。
1．5阻抑一催化褪色光度法
在鹽酸介質(zhì)中，鐵(Ⅲ)能靈敏地催化過氧化氫還原亮綠sF的反應(yīng)，綠原酸對催化反應(yīng)有靈敏的阻抑作用，耿玉珍等1據(jù)此建立了測定痕量綠原酸的阻抑一催化動力學(xué)光度分析方法。該方法測定綠原酸的線性范圍為0—0．12mg／L；檢出限為4．2×l0 g／L。對濃度為0．08 mg／L綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液6次平行測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3．8％；回收率為93．4％～1O5％，同時考察了反應(yīng)的最佳條件和動力學(xué)參數(shù)，探討了反應(yīng)機(jī)理，該方法用于測量金銀花浸取液中綠原酸的含量，取得了較為滿意的結(jié)果。
1．6 毛細(xì)管區(qū)帶電泳法
毛細(xì)管電冰分析具有分辨率高、分析速度快及環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，近年來已成為中藥質(zhì)量研究中的一種廣泛、有效的分析技術(shù)。顏流水等采用微波輔助萃取金銀花中的有效成分，用熔融石英毛細(xì)管柱(64．5cm ×50 m，有效長度56cm)作為分離通道；以30mmol· L 硼砂(pH=9．3)為運(yùn)行緩沖溶液；分離電壓20RV；毛細(xì)管柱溫25℃；檢測波長340 nm(綠原酸)和270nm(蘆丁、槲皮素)同時分離和測定金銀花中蘆丁、綠原酸和槲皮素的含量，為全面有效控制金銀花藥材質(zhì)量提供一種簡便、快速方法；龍虹I1。等提出了一種測定金銀花和含金銀花的八種中成藥中綠原酸標(biāo)志物的毛細(xì)管區(qū)帶電泳分析方法。所用的背景電解質(zhì)為含有l(wèi)Ommol／L磷酸鹽和20retool／L硼酸鹽的pH7．00的緩沖溶液，并含有5％的乙醇以提高樣品的溶解度。測定的線性范圍在27．765～665ug／mL，相關(guān)系數(shù)r 0．9996。測定金銀花和含金銀花的8種中成藥中的綠原酸可以在15rain內(nèi)完成。這種分析方法簡單、快速、適用面廣。
1．7高效液相色譜法
目前測定金銀花中綠原酸含量的主要方法還是高效液相色譜法。劉明斌等⋯用流動相：乙腈一0．1％磷酸(20：8O，v／v)；流速：0．8 ml／min，檢測波長：327nm，進(jìn)樣量：1O l；柱溫：室溫，在ODS柱上比較三種不同產(chǎn)地的金銀花中綠原酸的含量，并鑒別出含綠原酸含量較高的品種，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隆回縣金銀花綠原酸含量較高，河南密縣金銀花綠原酸含量較低，山東臨沂地區(qū)平邑縣金銀花綠原酸含量更低；劉恩荔等I1 l采用HypersilODS2色譜柱，以乙腈：水：冰醋酸(15：85：0．2)為流動相，流速0．8 ml／min，檢測波長327 nm，柱溫25℃建立測定金銀花有效部位中綠原酸含量的高效液相色譜法，作者比較了不同比例的冰醋酸，結(jié)果表明，當(dāng)冰醋酸的濃度為0．2％時，可得到較好的色譜峰峰形；王天志等I1 1建立了用反相高效液相色譜內(nèi)標(biāo)法梯度洗脫，同時測定金銀花中綠原酸、咖啡酸、3，5一二咖啡�？崴岷康姆椒�，并對4個產(chǎn)地3種金銀花中上述3種化合物進(jìn)行定暈分析。方法：采用島津CLC— ODS柱(6．0ram ×150ram)，甲醇一1O ％的磷酸氫二鈉和醋酸緩沖液流動相不同比例進(jìn)行梯度洗脫，內(nèi)標(biāo)物為水楊酸，檢測波長304nm。結(jié)果發(fā)現(xiàn)西南地區(qū)金銀花藥材主流商品灰氈毛忍冬、細(xì)氈毛忍冬干燥花蕾中綠原酸、咖啡酸、3，5一二咖啡酰奎尼酸含量高于山東、河南產(chǎn)金銀花。本法靈敏快速，準(zhǔn)確可靠。
2金銀花指紋圖譜
中藥指紋圖譜為在給定的色譜條件下，藥材中各組分的相對保留時間和相對峰面積為各組分所特有，如同人的指紋，利用相對保留時間和相對峰面積建立樣品的相對保留值指紋譜．通過對樣品色譜的數(shù)據(jù)化可產(chǎn)生一系列的參數(shù)，包括n強(qiáng)峰、特征峰群及特征指紋峰檢出率等，為鑒定和區(qū)分中藥材的品質(zhì)提供客觀依據(jù)。目前金銀花的指紋圖譜研究有GC法，HPLC法，HPCE法等。
2．1 GC法
田吉等” 1采用島津G C一1 4B；CR 一7Aplus數(shù)據(jù)處理器；SE一30石英毛細(xì)管柱(25m ×0．22mm)；柱溫90~C初溫，以4℃／min 升至200~C，40~C／min升至240~C保持；載氣：高純氮?dú)?．2ml／min；補(bǔ)充氣：氮?dú)?0ml／min，分流比1：10；氫氣40 ml／min；空氣500 ml／min；檢測器FID；檢測室245℃；氣化室235℃，建立了金銀花藥材的氣相色譜指紋圖譜。該法以芳樟醇為參照物，對11批金銀花進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其中24個峰為各批次共有的特征峰，選擇為共有指紋峰。得到金銀花藥材的氣相指紋圖譜。芳樟醇色譜峰分離度好．強(qiáng)度高，故選為參照物峰。以芳樟醇峰的保留時間及峰面積為1，計算其他各共有指紋峰的相對保留時間和峰面積比值，并對占總峰面積10％以上的峰計算峰面積比值差值，得到金銀花氣相指紋圖譜技術(shù)參數(shù)。結(jié)果表明金銀花氣相指紋圖譜穩(wěn)定性、重現(xiàn)性好、特征性強(qiáng)、峰面積比值及其差值、非共有峰面積均符合規(guī)定，結(jié)果穩(wěn)定可靠，可作為注射用金銀花藥材的鑒別標(biāo)準(zhǔn)之一。王斌等” 應(yīng)用GC色譜法建立了中藥金銀花的指紋圖譜，并對相似度計算軟件應(yīng)用過程中某些問題進(jìn)行了探討。方法：使用SGE 30QC3石英毛細(xì)管柱(30m ×0．32ram ×0．5“1TI)；柱溫：初溫100~C，以2℃／min 升至1 50℃，5℃／1TIin升至1 70℃保持40rain；載氣：高純氮?dú)猓髁浚?．0ml／min；尾吹氣：氮?dú)猓?0 ml／min，分流比1：10；氫氣，40 ml／min；空氣，400 ml／min；檢測器：FID；檢測器溫度：200~C；氣化室溫度：200~C。從此方法建立了藥材GC指紋圖譜共有模式，并對不同批藥材進(jìn)行了相似度比較，藥材各成分得到了很好的分離，可作為該藥材的指紋圖譜。
2．2 HPCE法
容蓉等I 以40 mmoL／L硼砂溶液為緩沖液，利用高效毛細(xì)管電泳法，建立不同產(chǎn)地金銀花的HPCE指紋圖譜。石英毛細(xì)管：57 cm x 75 m(有效長度50 cm)，工作電壓為17 kV，溫度為25℃，壓力進(jìn)樣時間為6 S，檢測波長：214 nm。通過對指紋圖譜特征峰數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，將不同產(chǎn)地的藥材分為3 類，并對各類樣品建立判別函數(shù)。利用指紋圖譜技術(shù)，通過聚類分析或建立判別函數(shù)，可以對不同產(chǎn)地的金銀花藥材進(jìn)行判別和質(zhì)量控制；孫國祥等11 7I采用毛細(xì)管區(qū)帶電冰法，以50 mmol／L硼砂(含20 mmol／L一環(huán)糊精，用磷酸調(diào)pH 8．0)為背景電解質(zhì)，運(yùn)行電壓12 kV，紫外檢測波長254nm，重力進(jìn)樣l5 s(高度8．5 cm)，建立了金銀花藥材水提取液的毛細(xì)管電泳指紋圖譜。將l3個不同產(chǎn)地的金銀花藥材供試液的毛細(xì)管電泳指紋圖譜進(jìn)行比較，以電泳峰出現(xiàn)率100％計，確定金銀花的共有指紋峰為l 8個，該方法具有較好的精密度和重現(xiàn)性，分離效能高且成本低廉。
2．3 HPLC法
白雪梅等I 1采用HPL C法建立金銀花的指紋圖譜。色譜條件為：色譜柱YGW —C18 (2 50mm x 4．6mm ，1 0 m)，檢測波長238nm，柱溫30℃，流動相：A液一0．4％磷酸水溶液，B液一乙腈，進(jìn)樣量為20 l，進(jìn)行梯度洗脫，所有組分在40min內(nèi)出峰，并對4個產(chǎn)地金銀花中所含的組分進(jìn)行綜合評價并測定其綠原酸含量，。結(jié)果為4個產(chǎn)地金銀花指紋譜主要特征大致相同，金銀花主要成分之一綠原酸含量與對照藥材相比無顯著性差異(p >0．05)；陽利龍以綠原酸為參照物，對產(chǎn)于山東2003—2004年不同采集時間的10批忍冬金銀花進(jìn)行甲醇提取物HPLC指紋圖譜方法的建立。色譜柱為ODS，(4．6mm ×250mm，5 1TI)，流動相：乙腈：0．4％磷酸(1 5：85)，柱溫：3 0℃，流速：1 1TIl／1TIi n，檢測波長：307nm。結(jié)果為藥材有15個共有峰，其參數(shù)符合”中藥注射劑指紋圖譜技術(shù)要求“的有關(guān)規(guī)定，可以作為金銀花質(zhì)量評價和品種鑒剮的重要依據(jù)之一；王倩等【l】用梯度洗脫法，對金銀花藥材進(jìn)行H P L C 測定。條件為：色譜柱Z0RBAX SB— C18(150mm ×4．6mm，5 m)；流動相：A相為1％醋酸水溶液，B相為甲醇進(jìn)行梯度洗脫；流速：1．0 mL／ml；檢測波長：254rim；柱溫：30℃。運(yùn)用梯度洗脫能很好分離金銀花的各類成分，經(jīng)方法學(xué)考察，HPLC指紋圖譜具有良好的重現(xiàn)性，l0批樣品中1 1個特征指紋峰有專屬性，此研究建立的金銀花藥材HPLC指紋圖譜分析法可用于金銀花藥材質(zhì)量的綜合評價
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金銀花提取物綠原酸含量測定及指紋圖譜研究進(jìn)展 NEWS
