綠原酸和菊花多糖免疫調(diào)節(jié)作用的研究 | 綠原酸和菊花多糖免疫調(diào)節(jié)作用的研究 |
| 發(fā)布時(shí)間:2018-04-26 信息來(lái)源:admin 發(fā)布人:admin 點(diǎn)擊次數(shù):1344 |
目的 探討菊花中綠原酸和多糖成分對(duì)腸道免疫功能的調(diào)節(jié)作用。方法 提取金菊花中多糖成分；分離大鼠腸道淋巴細(xì)胞，分別與菊花中多糖、綠原酸共培養(yǎng)，ＥＬＩＳＡ法檢測(cè)上清液中腫瘤壞死因子（ＴＮＦ）α和γ干擾素（ＩＦＮ）水平；比較菊花中多糖、綠原酸對(duì)腸道淋巴細(xì)胞免疫功能的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果 菊花多糖和綠原酸均可促進(jìn)淋巴細(xì)胞上清液中ＴＮＦα和γＩＦＮ水平升高；菊花多糖對(duì)腸道上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞影響較��；綠原酸對(duì)腸道上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞功能影響顯著。結(jié)論 金菊花中菊花多糖和綠原酸可調(diào)節(jié)腸道淋巴細(xì)胞分泌ＴＮＦα和γＩＦＮ，具有免疫調(diào)節(jié)功能。
［關(guān)鍵詞］綠原酸；免疫調(diào)節(jié) 菊花提取物 菊花提取物綠原酸 長(zhǎng)沙上禾生物
菊花是菊科植物菊（ＣｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍＲａｍａｔ）的干燥頭狀花序，為多年生草本，性味甘苦，具有疏風(fēng)、清熱、明目、解毒的功效，主治頭痛、眩暈、目赤、心胸?zé)�、療瘡、腫毒等，益血潤(rùn)容”�；瘜W(xué)成分研究表明菊花的成分比較復(fù)雜，其中黃酮類(lèi)化合物、三萜類(lèi)化合物和揮發(fā)油是其主要有效成分�，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，菊花具有抗菌、抗炎、抗氧化、舒血管、降血脂、抗腫瘤、驅(qū)鉛等多種藥理作用。有研究表明菊花中綠原酸含量較高，且綠原酸具有刺激腫瘤壞死因子（ＴＮＦ）α和γ干擾素（ＩＦＮγ）分泌的作用。但有關(guān)菊花免疫調(diào)節(jié)作用研究較少，菊花免疫調(diào)節(jié)成分不明。筆者最近的研究證明菊花中含有多糖類(lèi)物質(zhì)，且其含量較高，相對(duì)分子量較大，具有多糖類(lèi)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征。多糖為大分子化合物，研究發(fā)現(xiàn)多糖參與和介導(dǎo)了多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)，它們能夠刺激多種免疫細(xì)胞，促進(jìn)白細(xì)胞介素（ＩＬ）、ＴＮＦα、ＩＦＮγ等細(xì)胞因子的分泌，調(diào)節(jié)抗體和補(bǔ)體等來(lái)調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)。因此推測(cè)多糖為菊花免疫調(diào)節(jié)的有效成分。腸內(nèi)的淋巴細(xì)胞比任何器官多，且腸道接觸抗原的表面積最大，所以腸道是體內(nèi)最大的免疫器官。腸道相關(guān)的淋巴組織包括派伊爾結(jié)、黏膜歸巢受體、分散在黏膜固有層和腸上皮中的大量淋巴細(xì)胞［７］。因此本研究以腸道黏膜免疫系統(tǒng)為作用對(duì)象，篩選菊花中免疫調(diào)節(jié)活性成分，探討菊花多糖（ＤＭＰ）和綠原酸（ＣＧＡ）的免疫調(diào)節(jié)活性。
１ 材料與方法 １．１ 試藥 Ｆｉｃｏｌｌ（美國(guó)公司），ＤＨａｎｋ液，ＲＰＭＩ１６４０培養(yǎng)液（ＧＩＢＣＯ公司），Ｐｅｒｃｏｌｌ（美國(guó)Ｐｈａｒｍａｃｉａ公司），Ⅱ型膠原酶（美國(guó)Ｓｉｇｍａ公司產(chǎn)品），ＦＩＴＣ標(biāo)記ＣＤ４單克隆抗體、ＲＰＥ標(biāo)記ＣＤ４單克隆抗體、ＲＰＥＣｙ５標(biāo)記ＣＤ８單克隆抗體（美國(guó)Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ公司），γ干擾素ＥＬＩＳＡ試劑盒（晶美生物公司），ＴＮＦαＥＬＩＳＡ試劑盒（晶美生物公司）。金菊花鮮樣采自湖北荊州金菊花種植園，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院中藥師張玉良鑒定為ＤｅｎｄｒａｎｔｈｅｍａｍｒｉｆｏｌｉｕｍＴｚｖｅｌ．ｅｔＺｈａｏ。綠原酸（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：０７５３９９１０）。
１．２ 動(dòng)物 ＳＤ雄性大鼠，清潔級(jí)，體重（１９０±１０）ｇ， 由同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
１．３ 方法 １．３．１ 菊花多糖提取 參考文獻(xiàn)方法，以水提醇 沉法提取菊花多糖，制成注射劑備用。
１．３．２ 分離外周血單核細(xì)胞（ＰＢＭＣ） 取大鼠外周 血３ｍＬ，肝素抗凝，用Ｆｉｃｏｌｌ密度梯度離心法分離出單 核細(xì)胞。
１．３．３ 分離派伊爾結(jié)淋巴細(xì)胞（ＰＰ） 參照文獻(xiàn)［８］ 方法獲取派伊爾結(jié)，機(jī)械粉碎，制成ＰＢＳ混懸液，３００ 目篩網(wǎng)濾過(guò)，再利用Ｆｉｃｏｌｌ密度梯度離心法分離出淋 巴細(xì)胞。
１．３．４ 分離上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞（ＩＥＬ） 參考文獻(xiàn)［９］方法，取大鼠小腸，用含抗生素的ＤＨａｎｋ液沖洗腸腔，翻轉(zhuǎn)小腸使黏膜面向外，置于盛有消化液的離心管中。消化，過(guò)濾，離心。去上清液，加ＲＰＭＩ１６４０培養(yǎng)液。Ｐｅｒｃｏｌｌ非連續(xù)密度梯度離心法分離得上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞。
１．３．５ 分離腸道固有層淋巴細(xì)胞（ＬＰＬ） 將上述消化１次后的腸道組織加入含有０．１％Ⅱ型膠原酶的ＲＰＭＩ１６４０培養(yǎng)液中。再次消化，濾過(guò)、離心、去除上清液，加ＲＰＭＩ１６４０培養(yǎng)液。Ｐｅｒｃｏｌｌ非連續(xù)密度梯度離心法分離得腸道固有層淋巴細(xì)胞。
１．３．６ 細(xì)胞培養(yǎng) 將上述分離出的淋巴細(xì)胞加入含１０％胎牛血清培養(yǎng)液，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為１×１０６個(gè)/ｍＬ，取細(xì)胞懸液分別置于９６孔培養(yǎng)板，分別加入不同濃度菊花多糖（ＤＭＰ）和綠原酸（ＣＧＡ），對(duì)照組加入等量培養(yǎng)液。細(xì)胞置３７℃、５％ＣＯ２恒溫培養(yǎng)箱中孵育４８ｈ，定期觀(guān)察淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)情況，留上清液備用。
１．３．７�。桑疲�γ、ＴＮＦα水平檢測(cè) 參照試劑盒說(shuō)明書(shū)，檢測(cè)培養(yǎng)上清液中ＩＦＮγ和ＴＮＦα水平。向９６孔板中分別加入待測(cè)上清液和標(biāo)準(zhǔn)品１００μＬ，室溫下孵育２ｈ；用洗滌緩沖液洗５次，加入檢測(cè)抗體１００μＬ，室溫下孵育１ｈ；用洗滌緩沖液洗５次，加入辣根過(guò)氧化物酶底物１００μＬ，室溫下孵育３０ｍｉｎ；用洗滌緩沖液洗５次，加入底物１００μＬ，室溫孵育１５ｍｉｎ后，加入終止液５０μＬ，酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度（Ａ）值。
１．４ 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)量資料用ｘ±ｓ表示，組間比較用ｔ檢驗(yàn)。
２ 結(jié)果 ２．１ 對(duì)淋巴細(xì)胞上清液中ＩＮＦγ水平的影響 菊花多糖可以使外周血單核細(xì)胞（ＰＢＭＣ）和派伊爾結(jié)淋巴細(xì)胞（ＰＰＬ）上清液中ＩＮＦγ水平升高，與對(duì)照組比較，差異有極顯著性（Ｐ＜０．０１）；對(duì)派伊爾結(jié)淋巴細(xì)胞的作用在高劑量組時(shí)較大。菊花多糖對(duì)上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞（ＩＥＬ）上清液中ＩＮＦγ水平影響不大。綠原酸對(duì)上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞上清液中ＩＮＦγ水平影響較大，與對(duì)照組比較，差異有極顯著性（Ｐ＜０．０１）；綠原酸對(duì)腸道固有層淋巴細(xì)胞（ＬＰＬ）上清液中ＩＮＦγ水平影響較大，與對(duì)照組比較，差異有顯著性（Ｐ＜０．０５）（表１）。
２．２ 對(duì)淋巴細(xì)胞上清液ＴＮＦα水平的影響 菊花多糖刺激外周血單核細(xì)胞（ＰＢＭＣ）和派伊爾結(jié)淋巴細(xì)胞（ＰＰＬ）上清液ＴＮＦα水平升高，與對(duì)照組比較，差異有極顯著性（Ｐ＜０．０１）。綠原酸對(duì)上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞（ＩＥＬ）上清液中ＴＮＦα水平影響較大，與對(duì)照組比較，差異有極顯著性（Ｐ＜０．０１）。綠原酸對(duì)腸道固有層淋巴細(xì)胞（ＬＰＬ）上清液中ＴＮＦα水平也有影響，與對(duì)照組比較，差異有顯著性（Ｐ＜０．０５）。綠原酸高劑量時(shí)可促進(jìn)外周血單核細(xì)胞分泌ＴＮＦα，與對(duì)照組比較，差異有顯著性（Ｐ＜０．０５）。。
３ 討論 多糖是一類(lèi)由單糖組成的天然高分子化合物，廣泛存在于植物、動(dòng)物和微生物中。其中植物多糖如人參、枸杞、蘆薈、牛膝、刺五加等均具有顯著的藥效功能，如增強(qiáng)免疫功能、抗腫瘤、降血糖、抗衰老、抗病毒作用等。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明菊花多糖可以激活外周血和派伊爾結(jié)中的單個(gè)核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，調(diào)節(jié)ＩＦＮγ和ＴＮＦα的分泌，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。綠原酸在體內(nèi)體外可刺激淋巴細(xì)胞分泌ＴＮＦα和ＩＮＦγ。體外研究顯示綠原酸不僅可顯著增強(qiáng)流感病毒抗原引起的Ｔ細(xì)胞增殖，并且能誘導(dǎo)人淋巴細(xì)胞及人外周血白細(xì)胞生成ＩＦＮγ及ＩＦＮα。本研究結(jié)果與文獻(xiàn)結(jié)果一致。菊花多糖和綠原酸可調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞分泌ＴＮＦα和ＩＮＦγ，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，但作用效果卻有差異。二者免疫調(diào)節(jié)的作用機(jī)制有待深入研究。
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